大花萱草“東方不敗”的組織培養技術研究

楊麗莉，張 曉，張彥琴

（山西省農業科學院旱地農業研究中心，山西 太原 030006）

萱草（Hemerocallis hybrida）是百合科（Liliaceae）萱草屬（Hemerocallis）多年生宿根草本植物，主產于我國南、北方大部分地區，歐洲南部也有分布。該屬植物適應性廣，對土壤要求不嚴，花多為黃色、并可食用，在我國廣為人知。大花萱草通常稱為多倍體萱草，因其具有既觀花又觀葉的雙重價值而被廣泛用于切花、盆栽及園林綠化等，主要用途是觀賞。“東方不敗”是從歐美引進的多倍體品種，葉型修長似蘭草，叢生；株叢高35～45 cm。花葶粗壯，高50 cm，花朵碩大，直徑可達10 cm。花瓣外卷呈粉紅色，花心帶有金黃暈，色澤嬌艷，每葶可著花20余朵。花期6月中旬至9月中旬。其特點是:抗倒伏，復色花艷麗，花多且大，可反復開花，除了作綠化種植外，還可作切花。“東方不敗”萱草整株姿態優雅，嫵媚動人，甚是惹人喜愛，是大花萱草中重要的新品種。

自然界中，大花萱草一般以分蘗的方式進行繁殖，每年分蘗3～4株，繁殖速度慢，遠不能滿足商品化生產的需要。植物組織培養技術是指對引進和培育的新品種在短期內進行種苗的大量繁殖、用于生產建設的重要技術方法。科技工作者對大花萱草的組織培養研究已有部分報道[1-6]，但是不同大花萱草品種、不同外植體的培養方法和培養基配方存在較大差異，對“東方不敗”萱草的研究尚未見報道。

本試驗對大花萱草“東方不敗”組織培養技術中的關鍵技術參數進行了研究，旨在為實現組織培養工廠化育苗提供配套的技術服務。

1 材料和方法

1.1 材料

“東方不敗”是由北京紫鹿.艾維生種植園首次從國外引進的大花萱草品種，我們對其進行了引種和馴化栽培。供試材料來源于山西省農科院旱地農業研究中心大花萱草試驗田種植3 a的種苗，盛花期取花蕾作材料，以子房為外植體。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導分化培養 采摘苗圃健壯母株上發育正常的花蕾，用洗滌劑清洗表面后，用流水沖洗干凈。75%酒精消毒1 min，0.1%HgCl2滅菌15～20 min，無菌水沖洗4次。在無菌條件下剝離子房，橫切成片狀接種于愈傷組織誘導培養基（表 1）中，暗培養 35 d，溫度（25±1）℃，后進行光照培養26 d，光照強度2000～3000 lx。統計愈傷組織誘導分化率。

表1 愈傷組織誘導培養基設置 mg/L

1.2.2 不定芽的增殖培養 愈傷組織分化的不定芽接種于不同增殖培養基（表2）上，每瓶7芽，每種培養基10瓶。光照培養26 d后，統計苗數，計算繁殖系數。光照強度為2000～3000 lx，溫度為（25±1）℃。

表2 不定芽繼代繁殖培養基設置 mg/L

1.2.3 生根培養 無根小苗接種在不同的生根培養基（表3）上進行光培養，每瓶接7株，每種培養基接種10瓶。第10天起開始觀察、記錄生根情況。第27天測量根長，統計生根數，計算生根率。光照強度為2000～3000 lx，溫度為（25±1）℃。生根率＝生根苗數/接種小苗數×100%。

表3 生根培養基設置 mg/L

1.2.4 馴化栽培 在溫室內打開瓶蓋煉苗3 d后，取出小苗洗凈根部的培養基；再用0.1%多菌靈藥水洗根，移植在拱棚內不同基質的苗床上。移栽完畢后澆透水，并用0.1%的百菌清或多菌靈噴霧保苗。前1周遮蓋60%的遮陽網，并保持一定的溫度、濕度和光照。

2 結果與分析

2.1 子房愈傷組織的誘導分化培養

子房切片接種于10種不同激素配比和濃度配比的誘導分化培養基上，7～10 d子房切片開始膨大，15 d開始出現白色、松散狀愈傷組織。隨著培養時間的延長，白色、松散狀愈傷組織逐漸形成圓球狀、致密型、淡黃色胚性愈傷組織塊（圖 1）。在只有 6-BA 的培養基上（F1，F3，F5，F7，F9，F10），隨著 6-BA質量濃度的升高（1～6 mg/L），這種胚性愈傷組織越致密。在6-BA和2，4-D同時存在的 F2，F4，F6，F8號培養基上的胚性愈傷組織比單純6-BA培養基上的量大，結構緊密，色澤更鮮亮。

將這些愈傷組織轉入原號培養基進行繼代光照培養，觀察發現，愈傷組織的顏色由黃色變成黃綠色，并出現綠色的突起，繼而分化出不定芽（圖 2）。

從10種培養基愈傷組織分化率的結果（表4）看，F1～F4號培養基在 6-BA1～2 mg/L 的條件下，誘導分化率較低。F5～F8培養基6-BA為3～4 mg/L的范圍內，分化率提高，可達30.7%～38.2%。F9～F10號培養基上，隨著6-BA質量濃度的繼續升高（5～6 mg/L），分化率有所下降。在含有 2，4-D 的培養基上，F2，F4，F6，F8形成的愈傷組織比單純含 6-BA 的培養基 F1，F3，F5，F7量大，而不定芽的分化率普遍有所下降。因此，子房愈傷組織誘導分化最適宜的培養基為MS＋6-BA4mg/L。

表4 “東方不敗”萱草子房愈傷組織的誘導分化率

2.2 芽增殖培養

切下芽塊接種在不同的繼代繁殖培養基上進行光照培養，7 d左右開始形成叢生芽，25 d長滿1瓶（圖3）。

從表5可以看出，不定芽在Y1，Y2，Y3和Y4號培養基上的繁殖率高于 Y5，Y6號培養基。Y1，Y2，Y3和 Y4號培養基的 6-BA 質量濃度為 3 mg/L，Y5，Y6號為 2 mg/L，所以，繼代繁殖最適宜的6-BA質量濃度為3 mg/L。在添加同等濃度的 IBA和 NAA的培養基 Y3和 Y1，Y4和 Y2上，含IBA的Y3和Y4號培養基的繁殖系數高于含NAA的培養基Y2和Y1，并且IBA較高質量濃度（0.5 mg/L）的Y3培養基比IBA較低濃度（0.3 mg/L）的Y4培養基繁殖系數略高。因此，繼代繁殖適宜的培養基為MS＋6-BA 3 mg/L＋IBA 0.5 mg/L，繁殖系數可達6.4。

表5 “東方不敗”萱草在不同激素培養基上的繁殖系數

2.3 再生植株的生根培養

將繼代培養的小苗轉接入生根培養基，觀察小苗的生根時間、根的多少和根系的發育狀況，第27天測量根長，計算平均根長和平均生根數（圖4）。從表6和觀察結果可以看出，第9天時，除G1，G2培養基外，其他培養基上試管苗均開始出現大量白色根狀突起，其中，G4和G6號培養基的苗根狀突起最多，生根較早。第14天時，所有培養基中的苗都已生根，且根系粗壯。第16，18，21 天時，添加 NAA的 G4，G5，G6號培養基上試管苗的生根數明顯多于添加IBA的G1，G2，G3號培養基。第27天時，測量根長發現，NAA和IBA質量濃度分別在 0.2，0.4 mg/L（G4和 G5，G1和G2）時，平均根長無顯著差異。NAA的生根率顯著高于IBA的生根率。G3號培養基IBA質量濃度達到0.6 mg/L時，根長顯著增加。在NAA和IBA同時存在的G6號培養基上，根長且粗壯。從平均生根數來看，NAA質量濃度為0.4 mg/L時，平均生根數最高可達4.7條。由于后續過渡栽培成活率依賴于根數的多少、根長、根系粗壯度等綜合指標，所以，“東方不敗”的最佳生根培養基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖（或白糖）+6.5 g/L瓊脂粉。

表6 “東方不敗”在不同培養基、不同時間內的生根數及根長統計（70株）

2.4 苗的馴化與移栽

組培苗的過渡栽培環節是實現快繁的最后一個重要環節，其關鍵是保持介質的保水和透氣性、保持較低的溫度和較高的濕度。本試驗在移栽管理過程中發現，首先要用0.1%多菌靈藥水洗根，并在每周噴施1次0.1%的百菌清抑制雜菌；在介質的選擇上，選用廉價的粗河沙并且配以每周1次的MS營養液補充；溫度控制為24～28℃，相對濕度85%～90%，逐漸增加光照的條件下，移栽成活率均可達92%。

3 討論

（1）本研究中，以子房作為外植體，取花蕾作為消毒材料，可有效降低初代接種培養的污染率，而且取材量大。這與王曉娟等[5]的研究結果相同。

（2）在6-BA為1～2 mg/L時，愈傷組織誘導率很低；隨6-BA質量濃度升高到3～4 mg/L時，愈傷組織發生和生長較快，結構致密，色澤鮮黃。在光照條件下，伴隨著愈傷組織的發生和生長，分化出大量不定芽。從不同品種大花萱草的研究來看，對6-BA質量濃度的要求存在很大差異[6-10]，所以，在研究大花萱草的組織培養技術時，應該有針對性地研究不同品種的激素水平和激素配比。

（3）在大花萱草“東方不敗”的研究中，我們也發現，初代誘導愈傷組織時，愈傷組織的形成過程是先出現白色松軟的愈傷組織，隨著誘導時間的延長，愈傷組織變為淺黃色或黃色，致密顆粒狀。但是，愈傷組織在繼代分化培養時，不定芽的分化是伴隨著愈傷組織的生長同時進行的，不存在愈傷組織全部分化不定芽和全部生長為愈傷組織的情況，這與王曉娟等[5]的研究結果相同。不定芽的分化率和愈傷組織生長量大小之間的調節主要靠細胞分裂素的濃度進行。

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