簡青霉對酚類和苯胺類污染物的降解研究*

胡天覺,吳娟娟,曾光明,劉 暉,張 瀅,黃丹蓮,余 冰,沈瑩

(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長沙 410082;

2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410082)

簡青霉對酚類和苯胺類污染物的降解研究*

胡天覺?,吳娟娟,曾光明,劉 暉,張 瀅,黃丹蓮,余 冰,沈瑩

(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長沙 410082;

2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410082)

在培養(yǎng)4 d的簡青霉培養(yǎng)體系中,分別加入不同濃度的酚類和苯胺類物質(zhì),觀察這些有毒物質(zhì)對簡青霉生長的影響,并研究簡青霉對這幾種有毒物質(zhì)的降解效果.結(jié)果表明:低濃度的酚類和苯胺類物質(zhì)能促進(jìn)簡青霉的生長,高濃度的這些物質(zhì)則對簡青霉的生長有一定的抑制作用.同時(shí)簡青霉能夠很好地催化氧化苯酚,2,4-二氯苯酚和苯胺.當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度為500μg/ m L,2,4-二氯苯酚質(zhì)量濃度為50μg/m L,苯胺的質(zhì)量濃度為1 000μg/m L時(shí),簡青霉對這三者的降解率都接近100%.在2,4-二氯苯酚質(zhì)量濃度為60～125μg/m L,苯胺質(zhì)量濃度為2 000～5 000 μg/m L時(shí),簡青霉對它們的降解率分別達(dá)到60%和70%以上.簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺降解效果不明顯,在研究的濃度范圍內(nèi),簡青霉對它們的降解率只在10%左右.

苯胺類化合物;簡青霉;酚類化合物;生物降解

酚類化合物主要來源于煤氣廠、石油化工廠和制藥廠等,是重要的化工原料和中間體[1].苯胺類物質(zhì)是制藥、殺蟲劑、除草劑和染料等工業(yè)制備中重要的化工原料[2].由于它們對生物有機(jī)體的毒性作用,以及大多數(shù)難以生物降解,已被美國EPA列為優(yōu)先控制的污染物,在我國也被列為“水中優(yōu)先控制污染物”[2-3].

目前酚類和苯胺類化合物的降解方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法.與物理法和化學(xué)法相比,生物法具有成本低,效率高,反應(yīng)條件溫和以及無2次污染等優(yōu)點(diǎn).目前,在對微生物降解酚類和苯胺類化合物的研究中,大多數(shù)為細(xì)菌降解,如:惡臭假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、不動桿菌和紅球菌降解等[4-5].而細(xì)菌的生長容易受有機(jī)物濃度,廢水的pH值等因素的影響,尤其對重金屬很敏感.與細(xì)菌相比,真菌對有毒污染物具有較強(qiáng)的忍耐性和解毒作用.在酚類和苯胺類的污染中常伴隨著其它各種有害物質(zhì)的污染,因此利用真菌處理含酚廢水和含苯胺類廢水具有很大的應(yīng)用潛力.

本文研究簡青霉真菌對酚類和苯胺類污染物的降解,為難降解有機(jī)物的生物降解提供研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

無菌操作室,高壓蒸汽滅菌鍋,恒溫振蕩培養(yǎng)箱,濁度儀,離心機(jī),UV-2550紫外分光光度計(jì).

1.2 菌種和培養(yǎng)基

簡青霉由湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院863課題研究組提供.

固體培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):葡萄糖20 g,瓊脂15 g,去皮土豆200 g,蒸餾水1 000 m L.

液體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,NH4 Cl2.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,Na2HPO4?12H2O 0.504 g,MnSO4?H2O 0.039 g,CuSO4?5H2O 0.007 g,FeSO4?7H2O 0.007 g,蒸餾水1 000m L.

1.3 降解體系的建立

250 m L的錐形瓶中裝入100m L的液體培養(yǎng)基(即100/250m L的培養(yǎng)體系),在滅菌后的培養(yǎng)體系中無菌接入107個(gè)/m L的孢子懸浮液2 m L,于30℃,140 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng).4 d后在培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì),繼續(xù)振蕩培養(yǎng).每組實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行樣.有機(jī)物濃度的選擇根據(jù)文獻(xiàn)[6-10]確定.

1.4 降解率的測定

在振蕩培養(yǎng)4 d后的100/250 m L的培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì),以未加這些物質(zhì)的培養(yǎng)體系為對照樣,取適量菌液,6 000 r/m in離心15m in,過濾,取上清液,測初始濃度.繼續(xù)培養(yǎng),同樣方法分別測7 d后和10 d后的有機(jī)物濃度.最后結(jié)果用對照樣的菌液吸光度加以校正,計(jì)算降解率.

酚類化合物采用4-氨基氨替比啉法測定,苯胺類化合物采用萘乙二胺偶氮光度法測定[11].

1.5 漆酶活性測定

以ABTS為底物,反應(yīng)總體積為3 m L.取2.0 m L 0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH= 5.0),加入0.5 m L 5 mmol/L的ABTS和0.5 m L的粗酶液,混合于30℃水浴中反應(yīng)3 min,迅速測定OD420值.每個(gè)樣品重復(fù)做3次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%.對照組以同等體積的緩沖液代替粗酶液.酶活力單位(U)為:每分鐘催化1 m ol ABTS氧化所需的酶量.

粗酶液的制取:取一定量培養(yǎng)液,6 000 r/min離心15 min,再經(jīng)過孔徑為0.22 m的濾膜過濾.

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉生長的影響

2.1.1 酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉形態(tài)的影響

在振蕩培養(yǎng)條件下,簡青霉呈球狀生長,培養(yǎng)2 d后,菌球較小,4 d后菌球的直徑為3～4mm,生長較均勻,菌液呈微紅色.繼續(xù)培養(yǎng),10 d后菌球的直徑為5mm,并且菌球表面產(chǎn)生倒刺,如圖1所示.

圖1 對照樣的簡青霉形態(tài)Fig.1 Themorphology of Penicillium sim p licissimum cu ltured w ithout adding toxic substances

加入苯胺和對硝基苯胺后,菌液體系的顏色分別如圖2和圖3所示.在苯胺質(zhì)量濃度為4 000和5 000μg/m L時(shí),菌液呈褐色,且后者比前者的菌液顏色更深,其它濃度的菌液呈土黃色.當(dāng)加入不同濃度對硝基苯胺時(shí),各濃度體系中均有少量的黃色絮狀沉淀.繼續(xù)培養(yǎng),沉淀溶解,菌液顏色呈黃色,對硝基苯胺的濃度越高,菌液的顏色越深,且菌球也呈黃色,這是因?yàn)榫驅(qū)ο趸桨酚幸欢ǖ奈阶饔?加入苯酚、對硝基苯酚、2,4-二氯苯酚后菌液的顏色還是呈微紅色,與對照樣相比,未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化.

圖2 苯胺質(zhì)量濃度依次為1 000,2 000,3 000, 4 000和5 000μg/m L條件下培養(yǎng)的簡青霉形態(tài)Fig.2 Themorphology of Penicillium simp licissimum cu ltured w ith aniline at the concentration o f 1 000, 2 000,3 000,4 000,5 000μg/m L respectively

圖3 對硝基苯胺質(zhì)量濃度依次為50,100, 150和200μg/m L條件下培養(yǎng)的簡青霉形態(tài)Fig.3 Themorphology of Penicil lium simp licissimum cu ltured with p-nitroanilineat the concentration of 50,100,150,200μg/m L respectively

2.1.2 酚類和苯胺類物質(zhì)對菌球直徑的影響

培養(yǎng)10 d后的降解體系,在不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉的菌球直徑如表1所示.

表1 不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉菌球直徑Tab.1 The sphere diameter of Penicillium simp licissimum under different concentration of phenols and anilines

低濃度的有機(jī)物對簡青霉的生長影響不大,與對照樣中的菌球直徑相比,沒有明顯變化,菌球直徑都在5mm左右.有機(jī)物對簡青霉的毒性作用隨著有機(jī)物本身濃度的增加而增大,菌球直徑則隨有機(jī)物濃度的增加而減小.簡青霉在高濃度有機(jī)物作用下,菌球直徑是3～4 mm,當(dāng)苯胺的質(zhì)量濃度為4 000,5 000μg/m L時(shí),簡青霉的菌球直徑最小,為2～3 mm.

2.1.3 酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉生物量的影響

培養(yǎng)10 d后的降解體系經(jīng)6 000 r/min的離心機(jī)離心15m in后,過濾,菌體烘干至恒重,稱重,測量不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉的生物量.

由表2可以看出,與對照樣中的簡青霉生物量相比,在低濃度有機(jī)物的作用下,簡青霉的生物量有一定的增加,當(dāng)有機(jī)物的濃度逐漸增大時(shí),簡青霉的生物量則明顯減少.

表2 不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)作用下簡青霉生物量Tab.2 The biomass of Penicillium sim plicissimum under different concentration of phenols and anilines

2.2 液體培養(yǎng)條件下簡青霉的漆酶活性

在培養(yǎng)4 d后的體系中,分別加入苯酚、對硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺和對硝基苯胺,使它們在菌液體系中的質(zhì)量濃度分別為500,50,25,1 000和25μg/m L,每天取樣測酶活性,對照樣則在培養(yǎng)開始時(shí)每天取樣測酶活性.液體培養(yǎng)條件下的漆酶活性隨時(shí)間的變化如圖4所示.

圖4 液體培養(yǎng)條件下簡青霉漆酶活性Fig.4 Laccase activities o f Penicillium sim p licissimum in liquid cu ltivation

在培養(yǎng)的初始階段,漆酶的活性很低,幾乎接近零.隨著時(shí)間的增加,酶活性緩慢上升.在培養(yǎng)4～7 d時(shí),酶活性明顯增加,且變化率要大于培養(yǎng)8～10 d時(shí)的上升率.培養(yǎng)4 d后,加入酚類和苯胺類物質(zhì),漆酶的活性隨時(shí)間的變化趨勢和對照樣是一致的,只是在數(shù)值上有些微差異.剛加入污染物,漆酶活性相比于對照樣略有上升,在培養(yǎng)的后幾天漆酶活性與對照樣酶活性基本維持在一個(gè)水平.

2.3 簡青霉對幾種酚類和苯胺類物質(zhì)的降解

簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解如圖5所示.

簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解率隨酚類和苯胺類物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加逐漸減小.

簡青霉對苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺的降解效果較好.當(dāng)苯酚的質(zhì)量濃度在500μg/m L左右時(shí), 10 d后的降解率高達(dá)100%.當(dāng)2,4-二氯苯酚的質(zhì)量濃度為50μg/m L時(shí),降解率達(dá)到100%,隨著2,4-二氯苯酚濃度增加至90μg/m L時(shí),10 d后簡青霉對它的降解率減少至60%,且在一定的濃度范圍內(nèi),降解率均保持在60%以上.當(dāng)苯胺的質(zhì)量濃度為1 000,2 000μg/m L時(shí),簡青霉對它的降解率高達(dá)80%以上,質(zhì)量濃度為3 000,40 000和5 000 μg/m L時(shí),簡青霉對它的降解率均在60%左右.

簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺很難降解,當(dāng)對硝基苯酚質(zhì)量濃度為25μg/m L時(shí),降解率只有15%左右,在研究的濃度范圍內(nèi)簡青霉對對硝基苯酚的降解率均低于15%.當(dāng)對硝基苯胺質(zhì)量濃度為25μg/m L時(shí),降解率達(dá)到13%左右.可見簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺很難降解.

圖5 7 d和10 d后不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)的降解效果Fig.5 The degradation rate o f phenols and anilines in different concentrations by Penicil lium simp licissimum after 7 and 10 days

2.4 酚類和苯胺類物質(zhì)降解隨時(shí)間的變化關(guān)系

在培養(yǎng)4 d后的體系中,分別加入苯酚、對硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺和對硝基苯胺,使其在菌液體系中的質(zhì)量濃度分別為500,60,25,1 000, 25μg/m L.每天定時(shí)取樣.簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解隨時(shí)間的變化關(guān)系如圖6所示.

圖6 酚類和苯胺類物質(zhì)的降解隨時(shí)間的變化關(guān)系Fig.6 The degradation rate of pheno ls and anilines in the variation of time

簡青霉對苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺有很好的降解作用,在培養(yǎng)5～7 d時(shí),簡青霉對它們的降解作用比較明顯,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,降解率的增幅逐漸減小.而簡青霉對對硝基苯酚和對硝基苯胺較難降解,培養(yǎng)10 d后,降解率均低于20%.而且在降解的前幾天,簡青霉對它們基本上沒有降解.隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,降解率緩慢增加.

2.5 分析

在培養(yǎng)的初始階段,營養(yǎng)物質(zhì)比較充足,簡青霉大量生長,當(dāng)培養(yǎng)4 d以后,簡青霉的菌球直徑達(dá)到3～4 mm,菌球數(shù)量較多,營養(yǎng)物質(zhì)也被大量消耗, C,N源短缺,從而促進(jìn)漆酶的分泌.所以從圖4中可以看到,培養(yǎng)4 d以后漆酶活性較培養(yǎng)初期有大幅提高.培養(yǎng)7 d以后,漆酶仍呈增加的趨勢,只是增幅較前一階段有所下降.這與酚類和苯胺類物質(zhì)隨時(shí)間的降解情況是一致的(圖6).這說明,酚類和苯胺類物質(zhì)的降解與簡青霉漆酶活性有一定的關(guān)系,降解率隨漆酶活性的增加而增大.

低濃度的酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉的生長有一定的促進(jìn)作用,這是因?yàn)榈蜐舛鹊挠袡C(jī)物為簡青霉補(bǔ)充了一定的C,N源,促進(jìn)了簡青霉的生長,所以在低濃度的有機(jī)物作用下,簡青霉的生物量比對照樣中多,分泌的漆酶活性相比對照樣中的漆酶活性也要略高一點(diǎn).當(dāng)酚類和苯胺類物質(zhì)濃度逐漸增加,它們對簡青霉的毒性逐漸增強(qiáng),簡青霉的生物量和菌球直徑均低于對照樣中的值(表1,表2).說明高濃度的有毒物質(zhì)對簡青霉的生長有抑制作用.

從簡青霉對不同濃度酚類和苯胺類物質(zhì)的降解情況可以看出,簡青霉對低濃度有機(jī)物降解率高于對高濃度有機(jī)物的降解率,這可能是因?yàn)?首先,低濃度的有機(jī)物能成為簡青霉的營養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)簡青霉的生長,簡青霉的菌體數(shù)量增加,在代謝過程中分泌的漆酶較多;其次,有機(jī)物本身對簡青霉有一定的毒害作用,當(dāng)濃度很高時(shí)則會抑制簡青霉的生長,影響簡青霉的代謝.簡青霉能較好地降解苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺,而對對硝基苯酚和對硝基苯胺較難降解,這可能與對硝基苯酚和對硝基苯胺中的硝基有一定的關(guān)系.

3 結(jié) 論

1)低濃度酚類和苯胺類物質(zhì)對簡青霉生長有促進(jìn)作用,高濃度時(shí)對簡青霉生長有一定的抑制作用.

2)簡青霉對酚類和苯胺類物質(zhì)的降解隨時(shí)間的變化,與漆酶活性隨時(shí)間的變化規(guī)律一致.說明酚類和苯胺類物質(zhì)的降解與簡青霉分泌漆酶有關(guān).

3)簡青霉對苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺都有很好的降解能力,而對對硝基苯胺和對硝基苯酚的降解效果較差,這說明帶硝基的苯環(huán)物質(zhì)比不帶硝基的苯環(huán)物質(zhì)更難被簡青霉降解.

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Research on the Degradation Effect of Contaminants like Phenols and Anilines by Using Penicillium sim p licissimum

HU Tian-jue?,WU Juan-juan,ZENG Guang-ming,LIU H ui,ZHANG Ying, HUANG Dan-lian,YU Bing,SHEN Ying

(1.College of Environmental Science and Engineering,Hunan Univ,Changsha,Hunan 410082,China;2.Key Laboratory of
Environmental Biology and Pollution Control(Hunan Univ),Ministry of Education,Changsha,Hunan410082,China)

In order to study the grow th of Penicillium simp licissimum exposed to phenolsand anilines, and the deg radation of these toxic substances,several different concentrations of phenols and anilinesw ere added to the culture system,which was cultured for 4 daysw ith Penicillium sim p licissimum.The results have show n that low concentrations of pheno ls and anilines can p rom ote the grow th of Penicillium sim p licissimum,But on the contrary,the grow thw ould be restrained under the culture of high concentrations.M eanwhile,Penicillium sim p licissim um can catalyze and oxidize phenol,2,4-dich lorophenol and aniline effectively.When the concentration of phenol was controlled at 500μg/m L,2,4-dichlorophenol was 50μg/m L,and anilinew as1 000μg/m L,the degradation rates of phenol,2,4-dichlorophenoland anilinewere all close to 100%.When the concentration of 2,4-dichlorophenolwas controlled at 60～125μg/ m L and anilinew as 2 000～5 000μg/m L,the degradation rates were over 60%and 70%,respectively. However,the degradation effect of p-nitrophenol and p-nitroaniline by Penicillium sim p licissimum was worse,and their degradation rate was only about 10%.

phenolic compounds;Penicillium simp licissimum;aniline compounds;biological degradation

Q89

A

1674-2974(2011)04-0061-05 *

2010-05-07

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(07JJ5053)

胡天覺(1966-),男,湖南長沙人,湖南大學(xué)副教授,博士

?通訊聯(lián)系人,E-mail:hutj66@yahoo.com.cn.