峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460增殖的抑制作用觀察

馬超英 涂顯琴 牛順子 高雅蓉 唐靜 耿耘 蔣合眾

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，它嚴重影響人類生命健康，目前已成為世界上發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。峨參是傘形科峨參屬植物，與峨蕊、雪磨芋歷來被人們認為是峨眉山的三大特產而聞名遠近。中醫認為峨參有健脾益氣，活血化瘀的作用。有文獻報道從峨參根中提取出一種具有抗腫瘤活性的有效成分，結構研究表明是去氧鬼臼毒素(峨參內酯)，對人體子宮頸腺癌傳代細胞系的作用具有生物活性［1］，

而對肺癌的作用筆者尚未見文獻報道。本文主要研究峨參石油醚提取物對肺癌細A549和H460增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株A549和H460購自于四川大學華西國家重點實驗室。

1.2 藥品與試劑 RPMI-1640和胰蛋白酶均采用Gibco進口分裝，MTT購自寶信生物有限公司。峨參飲片購自于四川省峨眉山市仙山中藥飲片公司，經本院宋良科副教授鑒定為四川峨眉山產傘形科峨參屬植物峨參的干燥塊根。其余試劑均采用分析純。

1.3 主要儀器 CO2恒溫孵箱(3110型，美國Thermo公司)、細胞培養板、培養瓶(美國Coster公司)、酶標儀(Elx-800型，美國Bio-Tek公司)、離心機(L420型，長沙湘儀離心機有限公司)、倒置相差顯微鏡(日本索尼公司)、熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、超凈工作臺(BSW-880，江蘇蘇凈集團有限公司)、閃式提取器(JHBE-50型，河南金鼎科技有限公司)、旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1 峨參石油醚提取物的制備:將峨參切斷，粉碎成細小顆粒，過20目篩，烘干，用8倍量80%乙醇浸泡24 h，利用閃式提取器，分別間斷提取共3 min(15 000 r/min，1 800 W)，抽濾，得到濾液，旋轉蒸發儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取，得石油醚提取物，用旋轉蒸發儀回收溶劑，得浸膏，使用前用RPMI-1640調整至實驗所需濃度，DMSO(濃度＜0.05%)助溶。

1.4.2 細胞株培養:將肺癌細胞A549和H460接種于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基的培養瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規培養，每2天換液傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4.3 峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549、H460增殖抑制作用的檢測:取對數生長期細胞接種于24孔培養板內，2× 104個·ml-1·孔-1。細胞貼壁后加入不同濃度的峨參石油醚提取物，共設7個藥物濃度梯度，分別為1.25、2.5、5、10、20、40和80 μg/ml，每個濃度3個復孔，每孔體積500 μl，培養48 h后，每孔加入1 mg/ml MTT工作液500 μl，37℃放置4 h，棄上清，每孔加入500 μl 0.4%酸化異丙醇，220 r/min搖床震蕩5 min溶解結晶，經充分震蕩后，吸取200 μl至96孔酶標板于全自動酶標儀檢測570 nm波長處的各孔吸光度(OD值)，0.1%DMSO作為陰性對照，根據0.1%DMSO值繪制曲線，比較不同濃度峨參石油醚提取物對2個細胞株增殖的影響［2］。

1.4.4 DAPI染色:將潔凈無菌蓋玻片置于6孔板內，種入細胞培養過夜，使為60%～80%。設對照組、2.5 μg/ml、5 μg/ml峨參石油醚提取物組(A549)和對照組、1.25 μg/ml、2.5 μg/ml峨參石油醚提取物組(H460)，分別繼續培養24 h，吸棄廢液，然后用4%多聚甲醛固定細胞爬片35 min，1×PBS沖洗3次，每次2 min，加入2 μl DAPI染色液，染色15 min，1×PBS沖洗2次，取出爬片用封片液封片，熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發波長在350 nm左右，發射波長在460 nm左右。

1.5 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，實驗組及對照組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460增殖的抑制作用 結果顯示，隨著藥物濃度的升高，細胞存活率不斷下降，峨參石油醚提取物對肺癌細胞H460的抑制作用比對細胞A549明顯。經計算得出，峨參石油醚部位提取物對肺癌細胞A549和H460的IC50值分別為6.13 μg/ml和0.97 μg/ml，見圖1。

2.2 峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460凋亡的影響倒置顯微鏡觀察到，經峨參石油醚提取物處理48 h后，肺癌細胞A549和H460的生長明顯受到抑制，細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，細胞由梭形變成圓形細胞脫落，浮懸于培養液中［3］。熒光顯微鏡觀察到，經峨參石油醚提取物處理24 h后，肺癌細胞A549和H460生長明顯受到抑制，熒光增加，有明顯的細胞核斷裂和皺縮，隨劑量增加，細胞凋亡現象越明顯，見圖2。

圖1 不同濃度峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460生長的抑制作用

圖2 峨參石油醚提取物處理后細胞形態(×400)

3 討論

本實驗應用MTT比色法檢測峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460增殖的抑制作用，經計算得出其IC50值分別為6.13 μg/ml和0.97 μg/ml，且抑制率與濃度呈明顯的效應關系，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率不斷下降。用倒置顯微鏡觀察到，經峨參石油醚提取物處理肺癌細胞A549和H460后，癌細胞生長明顯受到抑制，細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，細胞由梭形變成圓形細胞脫落，浮懸于培養液中。不同濃度的峨參石油醚提取物作用于A549和H460細胞，24 h后用DAPI染色，熒光下可見細胞核發生明顯皺縮和斷裂。

綜上所述，本實驗通過對峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460的影響，為峨參抗腫瘤的研究提供了實驗依據，其抗腫瘤機制有待于進一步研究。

1 Yong Y，Shin SY，Y Lee YH，et al.Antitumor activity of deoxypodophyllotoxin isolated from Anthriscus sylvestris:Induction of G2/M cell cycle arrest and caspase-dependent apoptosis.Bioorg Med Chem lett，2009，19: 4367-4371.

2 鐘華，尹蓉莉，謝秀瓊，等.不同莪術提取物對小鼠皮膚癌的藥效研究.時珍國醫國藥，2010，21:2566-2567.

3 王維民，劉延慶，戴小軍.南蛇藤提取物誘導 SGC-7901胃癌細胞凋亡及其機制.中國生物制品學雜志，2010，23:154-156.