葉酸和維生素B12對(duì)糖尿病腎病患者氧化應(yīng)激水平的影響

羅惠辛 郭沛艷 宋淑萍 竇若蘭 胡若梅 王 娟 張向英

糖尿病腎病（DN）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病的主要病因。研究顯示高同型半胱氨酸（Hcy）血癥是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]，但與糖尿病尤其是DN的關(guān)系研究尚少，結(jié)論也不一致，與其相應(yīng)的干預(yù)措施更少，而其致病機(jī)制亦尚未完全闡明。本研究旨在通過觀察維生素B12、葉酸對(duì)DN患者血漿Hcy水平和氧化應(yīng)激的影響，以期為DN提供有效的防治方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇2006年7月—2008年7月在我院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病患者，且24 h尿白蛋白排泄0.3～1.0 g，排除其他疾病，如急慢性腎炎、充血性心力衰竭、發(fā)熱和泌尿系感染等引起的蛋白尿和腎功能不全，選擇DN患者共40例。用隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為2組，即DN1、DN2，每組20例。DN1為非干預(yù)組，給予控制血糖及相應(yīng)對(duì)癥治療；DN2為干預(yù)組，在控制血糖及相應(yīng)對(duì)癥治療的基礎(chǔ)上給予葉酸（FA）5 mg+維生素B12[VitB12，選用衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司甲鈷胺]500 μg口服，每日3次，干預(yù)時(shí)間為2周。

1.2 標(biāo)本采集和檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 給藥前后分別過夜空腹12 h，清晨取外周靜脈血13 mL，其中5 mL用于檢測(cè)生化指標(biāo)；3 mL于1 h內(nèi)送到免疫室測(cè)定Hcy、FA、VitB12水平；5 mL于2 h內(nèi)3 000 r/min離心20 min，吸取上清0.8～1.0 mL，編號(hào)后凍存于-20℃冰箱，用于血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的測(cè)定。同時(shí)監(jiān)測(cè)患者的收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）。

1.2.2 檢測(cè)方法 空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2 hPG）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、肝功能、總膽固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等均由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。糖化血紅蛋白（HbA1c）、24 h尿微量白蛋白由NycocardreaderⅡ儀器通過干化學(xué)法測(cè)定。Hcy測(cè)定采用熒光偏振免疫分析法。FA、VitB12使用gama計(jì)數(shù)儀采用雙標(biāo)記放免法。MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。SOD活力測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法。NO濃度測(cè)定采用硝酸還原酶法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s或M（P25，P75）表示。所有資料均進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布或方差不齊者，進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，干預(yù)措施前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般資料及相關(guān)指標(biāo)比較 2組DN患者干預(yù)前年齡、SBP、DBP、BUN、Cr、HbA1c、CHO、TG、LDL-C、HDL-C、病程等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性，見表1。2組FPG、2 hPG、FA、VitB12、Hcy、NO、MDA、SOD、24 h尿微量白蛋白等治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.2 2組患者干預(yù)前后FPG、2 hPG、Hcy、VitB12、FA、NO、MDA、SOD改變 干預(yù)2周后，DN1組FA、 VitB12、Hcy無明顯變化，而FPG、2 hPG、MDA及24 h尿微量的蛋白較干預(yù)前下降，NO、SOD較干預(yù)前升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。DN2組治療后患者的血清FA與VitB12水平均上升，Hcy水平下降，同DN1組相似FPG、2 hPG、MDA及24 h尿微量白蛋白較干預(yù)前下降，NO、SOD較干預(yù)前升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

2.3 2組FPG、2 hPG、NO、MDA、SOD、24 h尿微量白蛋白變化的比較 2組FPG、2 hPG干預(yù)前后的差值無明顯差異（P＞0.05），而DN2組NO、SOD上升幅度明顯大于DN1組，同時(shí)DN2組MDA及24 h尿微量白蛋白的下降幅度明顯大于DN1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

Hcy在細(xì)胞內(nèi)代謝處于再甲基化和轉(zhuǎn)硫化作用的交叉點(diǎn)，把FA、VitB6、VitB12相聯(lián)系起來。FA、VitB6、VitB12等維生素缺乏（營養(yǎng)因素）和Hcy代謝過程中的一些酶的基因突變（遺傳因素），均可導(dǎo)致血中Hcy的升高。補(bǔ)充FA、VitB6、VitB12是目前防治高同型半胱氨酸血癥的最常用、最經(jīng)濟(jì)和最有效的方法[2]，本研究結(jié)果表明口服FA+VitB12可降低DN患者血清Hcy。

表12 組DN患者一般資料和相關(guān)指標(biāo)比較 （n=20）

輕中度高同型半胱氨酸血癥可引起動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、腦血管病、外周血管病等多種疾病，是血管性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[3]。Hcy誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是其損傷心血管功能的最重要機(jī)制之一。Hcy可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，特別是通過Hcy的自身氧化、Hcy二硫化物的形成、同型半胱氨酸硫內(nèi)酯的形成以及蛋白質(zhì)的同型半胱氨酸化。Hcy與糖尿病大血管病變的關(guān)系已較明確，研究顯示Hcy水平與糖尿病微血管并發(fā)癥密切相關(guān)，高Hcy血癥可能參與了糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[4]。自Nakagawa等[5]發(fā)現(xiàn)NO合酶基因敲除的糖尿病小鼠更易形成典型的DN以來，NO在DN中的保護(hù)作用已經(jīng)明確，但日本一項(xiàng)研究顯示，在微量白蛋白尿階段的2型糖尿病患者與非糖尿病患者相比，其腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中NO合酶的表達(dá)增加[6]。Apakkan等[7]發(fā)現(xiàn)在早期腎小球體積增大、腎小球?yàn)V過率增加時(shí)，血、尿NO水平增加、血MDA水平增加，他們認(rèn)為NO水平升高可能會(huì)引起腎小球的高濾過和高灌注，引起尿微量白蛋白的排泄率增加，導(dǎo)致2型糖尿病患者早期腎臟疾病的進(jìn)展。筆者的研究表明2周后DN1和DN2 2組FBG、2 hPG、MDA、24 h尿微量白蛋白較干預(yù)前下降，NO、SOD較干預(yù)前升高。2組干預(yù)前后差值比較表明，2組FBG、2 hPG降低程度沒有明顯差別，但是DN2組MDA下降的幅度明顯大于DN1組，DN2組NO、SOD升高的程度亦明顯高于DN1組，同時(shí)DN2組24 h尿微量白蛋白干預(yù)前后的差值明顯高于DN1組。結(jié)合干預(yù)前后Hcy的變化，筆者認(rèn)為口服FA+VitB12可通過降低Hcy，進(jìn)一步降低DN患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，并減少24 h尿微量白蛋白。本研究NO檢測(cè)結(jié)果與Apakkan等[7]報(bào)道相反，可能與NO合酶有關(guān)，而NO合酶存在3種亞型，在Hcy作用的不同時(shí)期NO合酶活性表現(xiàn)并不一致。在DN的發(fā)展中，NO的合成經(jīng)歷了合成減少、活性增加、活性降低3個(gè)階段。在DN早期尋求相關(guān)的NO拮抗劑，晚期努力保持NO活性在合理水平，可能是治療DN的有效措施。

表2 2組DN患者干預(yù)前后相關(guān)指標(biāo)比較 （n=20，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；t1為配對(duì)前后比較結(jié)果，t2為2組干預(yù)前及變化差值比較結(jié)果

組別DN1 DN2 FPG（mmol/L） 2 hPG（mmol/L） FA（nmol/L）t1t1干預(yù)后6.32±0.88 6.32±0.64差值2.68±2.00 3.27±2.29 0.860干預(yù)前9.00±2.33 9.59±2.57 0.756 t1 5.991＊＊6.373＊＊干預(yù)后8.55±1.85 8.30±1.77差值5.66±3.30 5.76±3.71 0.095干預(yù)前14.20±4.79 14.06±4.40 0.096 7.657＊＊6.940＊＊干預(yù)后5.85±2.15 14.77±3.1 1.112 21.499＊＊干預(yù)前5.70±1.93 5.72±2.55 0.028 t2 組別VitB12（pmol/L） Hcy（μmol/L） NO（μmol/L）DN1 DN2 1.853 10.722＊＊干預(yù)前401.81±125.98 389.24±144.87 0.293干預(yù)后405.60±122.17 714.03±156.93 t1 t1 t1干預(yù)前25.63±2.49 25.04±2.75 0.709干預(yù)后25.46±2.58 14.85±1.48 1.989 18.181＊＊干預(yù)前63.05±11.77 66.03±15.53 0.684干預(yù)后106.28±26.10 132.34±39.05 7.434＊＊7.483＊＊t2差值43.24±26.01 66.31±39.63 2.177＊MDA（μmol/L） SOD（U/mL） 24 h尿微量白蛋白（g）組別t1 t1 t1 DN1 DN2干預(yù)后5.35±13.62 4.19±1.09 11.014＊＊14.629＊＊干預(yù)后84.03±15.80 96.31±18.47 12.365＊＊11.248＊＊干預(yù)后0.40±0.31 0.27±0.24 7.825＊＊6.699＊＊t2干預(yù)前7.95±1.51 7.62±1.32 0.751差值2.60±1.06 3.43±1.05 2.480＊干預(yù)前56.19±17.69 59.45±19.71 0.550差值27.83±10.07 36.87±14.66 2.272＊干預(yù)前0.73±0.33 0.80±0.55 0.476差值0.33±0.19 0.53±0.39 1.434＊

目前雖然FA和VitB12對(duì)臨床降低和消除高同型半胱氨酸血癥是有效的，但有關(guān)降低Hcy對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥影響的長(zhǎng)期、大規(guī)模臨床研究少見。補(bǔ)充維生素后的遠(yuǎn)期效果如何，停藥后有無反復(fù)及能否預(yù)防由高同型半胱氨酸血癥引起的氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，尚需更大規(guī)模前瞻性的研究進(jìn)一步論證。

[1]陳國威，徐鴻華.同型半胱氨酸與冠心病的關(guān)系探討[J].心腦血管病防治，2009，9（1）：40-41.

[2]吳乃君，魏劍芬，金秀平，等.2型糖尿病患者高同型半胱氨酸血癥與慢性血管并發(fā)癥的關(guān)系[J].中國糖尿病雜志，2007,15(6): 357-359.

[3]Humphrey LL,Fu R,Rogers K,et al.Homocysteine level and coro?nary heart disease incidence:a systematic review and mata-analysis [J].Mayo Clin Proc,2008,83(11):1203-1212.

[4]de Luis DA,Fernandez N,Arranz ML,et al.Total homocysteine lev?els relation with chronic complications of diabetes,body composi?tion,and other cardiovascular risk factors in a population of pa?tients with diabetes mellitus type 2[J].J Diabetes Complications, 2005,19(1):42-46.

[5]Nakagawa T,Sato W,Glushakova O,et al.Diabetic endothelial ni?tric oxide synthase knockout mice develop advanced diabetic ne phropathy[J].J Am Soc Nephrol,2007,18(2):539-550.

[6]Anan F,Masaki T,Umeno Y,et al.Correlations of urinary albumin excretion and atherosclerosis in Japanese type 2 diabetic patients [J].Diabetes Res Clin Pract,2007,77(3):414-419.

[7]Apakkan AS,Ozmen B,Ozmen D,et al.Serum and urinary nitric ox?ide in Type 2 diabetes with or without microalbuminuria:relation to glomerular hyperfiltration[J].J Diabetes Complications,2003,17(6): 343-348.