乳源β-酪啡肽-7對高血糖大鼠小腸黏膜氧化應激的影響

印 虹，馬 暢，韓東寧，張源淑

乳源β-酪啡肽-7對高血糖大鼠小腸黏膜氧化應激的影響

印 虹，馬 暢，韓東寧，張源淑*

(南京農業大學 農業部生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

為了探討主要的乳源活性肽β-酪啡肽-7對高血糖大鼠小腸黏膜氧化應激損傷的保護作用。本研究選用SD雄性大鼠43只，隨機取35只誘導高血糖模型，另8只作為空白對照。造模成功大鼠24只隨機分為高、低劑量組和模型對照組。高、低劑量組每12h灌胃β-CM-7溶液1mL，高劑量組β-CM-7濃度為7.5×10-6mol/L，低劑量組β-CM-7濃度為7.5×10-7mol/L，模型對照組、空白對照組大鼠按等體積蒸餾水灌胃。連續灌胃30d后，斷頸處死，取血漿、小腸黏膜等進行小腸黏膜Na+-K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性與丙二醛含量測定。結果表明：低劑量組能顯著提高高血糖大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力及CAT活力(P＜0.05)；高、低劑量組均能顯著提高高血糖大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px酶活力(P＜0.05)；低劑量組能顯著降低高血糖大鼠小腸黏膜MDA含量。結論：β-CM-7可以通過上調小腸黏膜SOD、GSH-Px等抗氧化應激酶活性，緩解高血糖氧化應激產生的自由基對機體小腸黏膜的損傷。

高血糖；小腸黏膜；Na+-K+-ATP酶；氧化應激

糖尿病是威脅人類健康的三大殺手之一。近年來發現糖尿病及其并發癥的發生與機體的氧化應激增加有關。許多研究表明，糖尿病的高血糖等因素使大鼠氧自由基大量產生，且清除氧自由基的酶 SOD、GSH-Px等因非酶性糖基化反應而活性降低，對自由基的清除減少，兩者共同導致氧化應激加重。氧化應激損害胰島素合成和分泌，損害肌肉、脂肪和肝臟等組織細胞正常生理功能，使得血糖持續升高，促進了糖尿病的發生和發展[1]，氧化應激已經成為糖尿病發生發展的一個重要原因[2]。預防和抵抗糖尿病及其并發癥的關鍵不僅要控制血糖，抗氧化劑用于糖尿病的治療也已經開始起步。

β-酪啡肽-7(β-CM-7)是由酪蛋白酶解產生的最具代表性的一種乳源生物活性肽，由7個氨基酸組成。研究發現β-CM-7具有多種生物學功能，如促進仔豬小腸絨毛的生長[3]；提高斷奶仔豬胃腸道細胞免疫和黏膜免疫活性[4]；下調小腸黏膜鈉葡萄糖共轉運載體(SGLT-1)、葡萄糖協助擴散轉運載體(GLUT-2)mRNA的轉錄，減少大鼠小腸對葡萄糖的吸收[5]等。宗亞鋒[6]的研究證實β-CM-7能夠抑制小腸葡萄糖的吸收，有輔助降血糖作用。也有研究從酪蛋白的胃蛋白酶酶解物中分離并鑒定了具有自由基清除活性的肽[7]。β-CM-7對于小腸黏膜抗氧化應激的研究卻未見報道。

本研究擬以鏈脲佐菌素誘導大鼠高血糖模型，結合小腸黏膜MDA、SOD、GSH-Px等指標的變化，探討β-CM-7對糖尿病持續高血糖大鼠小腸黏膜抗氧化應激的作用，為挖掘β-CM-7對于糖尿病治療的潛在價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SD大鼠，雄性，購自浙江省實驗動物中心(許可證號：SCXK(浙)2008-0033)；標準鼠糧購于江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；大鼠飼養于南京農業大學農業部動物生理生化重點開放實驗室動物房。

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)、β-酪啡肽-7 (β-Casomorphin-7，β-CM-7) 美國Sigma公司；Na+-K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；STZ用0.1mol/L、pH4.2 的檸檬酸鈉緩沖液溶解，配成4mg/mL的溶液，現用現配；其他試劑為國產分析純。

怡成血糖儀、怡成虹吸式血糖試紙 北京怡成生物電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 STZ 致高血糖模型的建立

參照余傳林[8]的方法。SD大鼠43只，雄性，體質量120～140g，隨機取其中35只作為高血糖模型組，另8只作為空白對照組。給藥前大鼠禁食、過夜，高血糖模型組大鼠按60mg/kg(以體質量計)一次性腹腔注射STZ溶液，另8只對照組大鼠按同樣方法腹腔注射等體積生理鹽水。給藥后大鼠自由采食與飲水，觀察并記錄攝食與飲水的變化。

分別于注射STZ后24、72h剪尾取血，用血糖儀測定所有實驗動物的空腹(禁食8h)血糖。以空腹條件下血糖值≥14mmol/L為高血糖造模成功。

1.2.2 動物分組和樣品采集

取造模成功大鼠24只隨機分為β-CM-7高劑量組(7.5× 10-6mol/L)，β-CM-7 低劑量組(7.5×10-7mol/L)和β-CM-7模型對照組(0mol/L)。每12h灌胃β-CM-7溶液1mL，模型對照組和空白對照組大鼠按等體積蒸餾水灌胃。30d后，斷頸處死所有大鼠，取血漿、小腸黏膜等組織，-70℃保存。

1.2.3 小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力測定

將刮取的腸囊黏膜按照試劑盒說明書檢測其Na+-K+-ATP酶活力。

樣本前處理：準確稱取腸黏膜組織50mg加入生理鹽水450μL制成10%的勻漿，3500r/min離心10min，取上清液再用生理鹽水按1:4稀釋成2%的勻漿待測。Na+-K+-ATP酶活力測定按試劑盒說明書進行。

1.2.4 小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT酶活力以及MDA含量的測定

按試劑盒說明書進行測定。

1.2.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 β-CM-7對大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力的影響

圖1 β-CM-7對大鼠大腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力的影響(n=8)Fig.1 Effect of β-casomorphin -7 on the activity of Na+-K+-ATPase in small intestine mucosa (n=8)

由圖1可知，模型對照組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力顯著低于空白對照組(P＜0.05)。而低劑量組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力顯著高于模型對照組大鼠(P＜0.05)。

2.2 β-CM-7對大鼠小腸黏膜MDA含量的影響

MDA是機體氧化應激的重要標志物之一。由表1可知，模型對照組大鼠小腸黏膜MDA含量顯著高于空白對照組大鼠(P＜0.05)；低劑量組大鼠小腸黏膜MDA含量要顯著低于模型對照組大鼠(P＜0.05)。

表1 大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力以及MDA含量(n=8)Table 1 Activities of SOD, GSH-Px and catalase and the levels of MDA in small intestine mucosa in control and treatment groups of rats (n = 8)

2.3 β-CM-7對大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力的影響

由表1可知，模型對照組大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px活力顯著低于空白對照組大鼠(P＜0.05)。而高劑量組大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px活力均顯著高于模型對照組大鼠(P＜0.05)，低劑量組大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力均顯著高于模型對照組大鼠(P＜0.05)。

3 討 論

STZ被廣泛用于實驗糖尿病大鼠模型的誘導[9]，STZ對胰島β細胞有特異的毒力作用，其機制[10-11]是其對DNA的烷基化，繼而激活了DNA聚合酶的切除修復途徑?；罨腄NA聚合酶使得胰島NAD+耗竭，加劇了胰島β細胞的凋亡。STZ誘導的動物模型是Ⅰ型糖尿病，表現為胰島素的缺乏、高血糖特征。本實驗采用STZ腹腔注射誘導的35只大鼠中，有24只空腹血糖穩定維持在14mmol/L以上，表明本實驗STZ誘導高血糖大鼠模型成功。

機體在高血糖的狀況下代謝紊亂，自由基的產生加劇，自由基的清除處于失衡狀態，因此機體處于氧化應激的狀態[1]。MDA是公認的氧化應激的標志物之一[12]。本實驗中模型對照組大鼠小腸黏膜MDA含量顯著高于空白對照組大鼠(P＜0.05)，提示高血糖時小腸黏膜與大量文獻[1-2,13]報道的肝臟、肌肉等一樣，也處于氧化應激狀態。低劑量灌胃β-CM-7能顯著降低糖尿病大鼠小腸黏膜的MDA含量(P＜0.05)，表明β-CM-7能減輕糖尿病大鼠小腸黏膜的氧化應激水平，對高血糖所致的小腸黏膜損傷有一定的抵抗作用。

機體抵抗氧化應激[14]主要通過兩個途徑進行。即：1)提高抗氧化應激酶的活性，包括SOD、GSH-Px、CAT等；2)通過食物攝入一些抗氧化物質，如：VA、VC、VE等。胡文琴等[7]研究發現，酪蛋白的酶解物具有較強的抗氧化作用，其作用機制可能與直接清除活性氧、提高SOD活性或是抑制膜性結構上的脂質過氧化作用有關。本實驗中模型對照組大鼠小腸黏膜SOD等活力的降低，使得小腸黏膜氧化應激程度加劇，與文獻[1]報道結果一致。高劑量的β-CM-7灌胃能顯著提高糖尿病大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px活力，低劑量的β-CM-7灌胃能顯著提高糖尿病大鼠小腸黏膜SOD、GSH-Px、CAT活力，提示β-CM-7能通過上調小腸黏膜抗氧化應激的酶活力來增強其抗氧化應激的能力，等與胡文琴等[7]的研究結果一致。

小腸黏膜是機體主要的消化吸收場所。大部分營養物質(例如葡萄糖、氨基酸)的吸收是通過小腸黏膜進行的[15]，葡萄糖的吸收屬于主動運輸，需要Na+-K+-ATP酶提供能量。本實驗中模型對照組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力與空白對照組相比，顯著降低(P＜0.05)，灌胃酪啡肽后Na+-K+-ATP酶活力高于模型對照組。Maeda等[12]報道機體或組織若處于氧化應激的狀態，過多的自由基會進攻酶的活性中心，使得一些重要的酶或者蛋白質失去其生理學功能。本實驗中模型對照組小腸黏膜中Na+-K+-ATP酶活力下降，推測其與小腸黏膜處于氧化應激的狀態有關。

綜上所述，持續高血糖可以引起小腸黏膜處于氧化應激狀態，β-CM-7可以通過顯著上調小腸黏膜SOD、GSH-Px等抗氧化應激酶的活性，提高小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力，增強小腸黏膜抗氧化應激的能力，緩解高血糖氧化應激產生的自由基對小腸黏膜的損傷，即β-CM-7對糖尿病大鼠小腸黏膜有一定的保護作用。

[1]VALKO M, LEIBFRITZ D, MONCOL J, et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2007, 39(1): 44-84.

[2]NEWSHOLME P, HABER E P, HIRABARA S M, et al. Diabetes associated cell stress and dysfunction: role of mitochondrial and nonmitochondrial ROS production and activity[J]. Journal of Physiology-London, 2007, 583(1): 9-24.

[3]潘翠玲, 鄒思湘, 陳偉華, 等.β-酪啡肽7對早期斷乳仔豬消化道發育的影響[J]. 中國獸醫學報, 2006, 26(1): 78-81.

[4]張源淑, 鄧艷, 宋曉丹, 等. 酪啡肽及其酪蛋白水解肽對早期斷奶仔豬分泌型免疫球蛋白A和細胞因子水平的影響[J]. 動物營養學報,2008, 20(2): 196-199.

[5]宋曉丹, 左偉勇, 范英蘭, 等. 乳源β-酪啡肽7對大鼠葡萄糖吸收的影響及其作用機制[J]. 世界華人消化雜志, 2009, 17(19): 1947-1951.

[6]宗亞峰. β酪啡肽在胃腸道內的釋放、吸收和穩定特性及其對胃腸機能的影響[D]. 南京: 南京農業大學, 2007: 104-107.

[7]胡文琴, 王恬, 霍永久, 等. 酪蛋白酶解物體外抗氧化作用的研究[J].食品科學, 2004, 25(4): 158-162.

[8]余傳林, 朱正光. 鏈脲佐菌素糖尿病模型動物血糖及體征動態變化的研究[J]. 南方醫科大學學報, 2008, 28(1): 132-133.

[9]SZKUDELSKI T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action inβ-cells of the rat pancreas[J]. Physiol Res, 2001, 50(6): 537-546.

[10]BENNETT R A, PEGG A E. Alkylation of DNA in rat tissues following administration of streptozotocin[J]. Cancer Res, 1981, 41(7): 2786-2790.

[11]BOLZAN A D, BIANCHI M S. Genotoxicity of streptozotocin[J]. Mutat Res, 2002, 512(2/3): 121-134.

[12]MAEDA Y, INOGUCHI T. Oxidative stress[J]. Nippon Rinsho, 2010, 68(5): 814-818.

[13]WANG Q, PFISTER F, DORN-BEINEKE A, et al. Low-dose erythropoietin inhibits oxidative stress and early vascular changes in the experimental diabetic retina[J]. Diabetologia, 2010, 53(6): 1227-1238.

[14]HAMDEN K, BOUJBIHA M A, MASMOUDI H, et al. Combined vitamins (C and E) and insulin improve oxidative stress and pancreatic and hepatic injury in alloxan diabetic rats[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2009, 63(2): 95-99.

[15]鄒思湘. 動物生物化學[M]. 4版. 北京: 中國農業出版社, 2005: 102-103.

Effects of β-CM-7 on the Oxidative Stress of Small Intestine Mucosa in Diabetic Rats

YIN Hong，MA Chang，HAN Dong-ning，ZHANG Yuan-shu*
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The present study was aimed to investigate the possible protective effects of β-casomorphin -7 in small intestine mucosa in diabetic rats. A total of 43 male SD rats were used for this stud and were divided into two groups of control (n = 8) and hyperglycemia group (n = 35). The hyperglycemia rats (n = 24) were randomly divided into three groups: positive control rats, high dose β-CM-7 treated diabetic rats, and low dose β-CM-7 treated diabetic rats. On the last day of treatment, the animals were deprived of food overnight and sacrificed by cervical dislocation. Blood was collected at the presence of anticoagulant and the small intestine mucosa was obtained. The MDA level and the activity of Na+-K+-ATPase, SOD, GSH-Px, and CAT of small intestine mucosa were measured. The results showed after 30 days oral administration of β-casomorphin -7, the activity of Na+-K+-ATPase was markedly increased compared with positive control rats. Oral administration of high or low does of β-CM-7 to diabetic rats showed an increase in the activity of SOD, and GSH-Px, and low does also showed the reducing function on the elevated MDA level in diabetic rats. Thus the results of the present study suggest that β-casomorphin -7 can decrease the oxidative stress in small intestine mucosa in diabetic rats by elevating the activity of enzymatic antioxidants including SOD and GSH-Px.

hyperglycemia；small intestine mucosa；Na+-K+-ATPase；oxidative stress

S858

A

1002-6630(2011)03-0208-04

2010-05-24

印虹(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為生物活性肽。E-mail：2008107031@njau.edu.cn

*通信作者：張源淑(1962—)，女，教授，博士，研究方向為生物活性肽。E-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn