大葉紫薇葉水提物對氧化損傷下胰腺細胞的保護作用

宋家樂

(釜山國立大學食品科學和營養學科，韓國 釜山 609735)

大葉紫薇葉水提物對氧化損傷下胰腺細胞的保護作用

宋家樂

(釜山國立大學食品科學和營養學科，韓國 釜山 609735)

探討大葉紫薇葉水提物對氧化損傷下HIT-T15細胞的保護作用及其對胰島素分泌量的影響。通過檢測細胞內Akt蛋白質表達量并結合ELISA法檢測大葉紫薇葉水提物對HIT-T15細胞胰島素分泌量的影響。同時，結合細胞內線粒體膜電位改變程度和抗凋亡蛋白質Bcl-2表達量以研究其分子層面的抗凋亡機制。結果提示，大葉紫薇葉水提物可抑制氧化損傷下HIT-T15細胞的凋亡，并可改善受損細胞自身的胰島素分泌能力。

大葉紫薇；氧化損傷；抗凋亡；胰島素分泌

大葉紫薇(Lagerstroemia specious L.)又名巴拿巴(banaba)，屬千屈菜科薔薇屬落葉喬木。該植物的花、莖、果、葉皆具有傳統中藥的保健功效[1]。研究表明，巴拿巴水提物可顯著降低糖尿病小鼠血糖及改善小鼠體內胰島素水平[2]，促進脂肪細胞的葡萄糖利用，抑制脂肪細胞分化[3]，減輕糖尿病小鼠體質量[4]。近年來，巴拿巴獨特的抗糖尿病功效日益引起各國科學家的關注，其主要抗糖尿病活性成分為單寧酸、科羅索酸、熊果酸及三萜類化合物等[5-8]，但其抗糖尿病機理還不甚清楚。近年研究表明，氧化應激損傷是糖尿病的病因之一，氧化應激損傷可導致胰腺β細胞凋亡并影響其正常的胰島素分泌功能，進而影響機體的代謝[9-10]。HIT-T15敘利亞倉鼠胰腺β細胞為常用的研究胰島素分泌機制的細胞模型[11]。 3-morpholinosydnonimine(SIN-1)又名3-瑪琳-斯得酮亞胺，為一類含亞胺的過氧化硝基化合物，可在體內代謝生成NO和O2·。而后兩者又可生成ONOO-這一毒性自由基。為研究體內胰腺細胞氧化應激損傷機制，本實驗以SIN-1誘發敘利亞倉鼠胰腺細胞氧化應激損傷造模，通過觀察大葉紫薇葉水提物(BWE)對氧化損傷下HIT-T15細胞的保護作用，并通過測定其對胰島素分泌量的影響，對其分子層面上抗糖尿病的機理進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大葉紫薇葉購自于韓國大邱廣域市韓藥市場。

HIT-T15敘利亞倉鼠胰腺β細胞購自美國ATCC。

RPMI 1640細胞培養液、青-鏈霉素雙抗、0.05% Trypsin-EDTA、胎牛血清 美國Invitrogen公司；噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、SIN-1、RIPA緩沖液、JC-1熒光染料 美國Sigma公司。本實驗中所有抗體均購自美國CELL Signal公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

R-114旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；MCO96二氧化碳細胞培養箱 日本三洋電機株式會社；VS-15CFN冷凍離心機 韓國Vision科學株式會社；PM-10AK倒置顯微鏡、BX 51 熒光顯微鏡 日本奧林巴斯光學株式會社；BIO-RAD 680酶標儀、BIO-RAD MicroRoTofor電泳儀 美國Bio-Rad公司；CYTOMICS FC500流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 大葉紫薇葉水提物制備

取160g大葉紫薇葉加入1L蒸餾水，沸騰提取2h。0.45μm針式濾器濾過，經旋轉蒸發制得大葉紫薇葉水提物。將該水提物溶于磷酸緩沖液(PBS)制備成質量濃度為50mg/mL的儲備液，-4℃保存備用。

1.3.2 敘利亞倉鼠胰腺β細胞培養及氧化損傷造模

HIT-T15細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗(青-鏈霉素)的RPMI 1640細胞培養液中，每3d更換培養基一次，待用。取適量生長期細胞，按5 × 103個/mL，每孔100μL接種于96孔細胞培養板，37℃、5% CO2濕化培養24h。待細胞完全貼壁后，用濃度為50μmol/L的SIN-1處理細胞24h，即制備得氧化損傷細胞模型。

1.3.3 MTT法測定細胞生存率

HIT-T15細胞按5 × 103個/mL，每孔100μL接種于96孔細胞培養板，37℃、5% CO2濕化培養24h。細胞完全貼壁后，設立空白組和樣品組進行實驗。連續培養48h后，吸出孔內培養基并加入150μL MTT溶液(終質量濃度 0.5mg/mL)繼續培養4h。待培養結束后吸棄上清液，每孔加入150μL DMSO-乙醇(體積比1:1)混合液，避光振蕩30min，用多孔酶標儀于540nm波長處測定O D值，計算細胞生存率。

1.3.4 胰島素分泌量測定

HIT-T15細胞按5 × 103個/mL 接種于96孔板內。細胞貼壁后，設空白組和樣品組，連續培養48h后，取10μL上清液按照試劑盒說明書操作，于450nm波長處測定OD值并計算胰島素分泌量。

1.3.5 線粒體膜電位測定

適量細胞按5×105個/mL接種于6孔細胞培養板中。待完全貼壁后，設立空白組、樣品組，加入JC-1(5μg/mL)熒光染料，37℃孵育20min。PBS沖洗兩次后，置于Beckman CYTOMICS FC500流式細胞儀并結合Beckman Coulter CXP2.0分析軟件測定細胞線粒體膜電位，

1.3.6 West-Blotting測定

取適量細胞，用冷PBS緩沖液沖洗兩次后，置于冰上，用RIPA細胞裂解緩沖液抽取細胞總蛋白質。經Bio-Rad蛋白定量試劑盒定量后，取30μg細胞總蛋白，10% SDS-PAGE分離膠分離，濕法電轉蛋白至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃振蕩過夜，T-PBS洗膜，二抗室溫孵育1h。T-PBS洗膜后，ECL增強型化學發光法曝光并拍照分析。

2 結果與分析

2.1 BWE對HIT-T15細胞的毒性作用。

MTT法檢測經不同質量濃度BWE處理24、48h后HIT-T15細胞生存率。如圖1所示，BWE對HIT-T15細胞無明顯的細胞毒性作用。

圖1 大葉紫薇葉水提物對HIT-T15細胞的細胞毒性作用Fig.1 Effect of BWE on cell viability of HIT-T15 cells

2.2 BWE對HIT-T15細胞氧化損傷保護的影響

圖2 BWE對HIT-T15細胞氧化損傷保護的影響Fig.2 Effect of BWE on cell viability of oxidation-damaged HIT-T15 cells

MTT法檢測不同濃度大葉紫薇葉水提物對氧化損傷(經50μmol/L SIN-1處理)下HIT-T15細胞模型的保護作用，結果如圖2所示。大葉紫薇葉水提物可有效保護氧化損傷下HIT-T15細胞，提高其生存率。且作用效果隨提取物質量濃度的增加而增強。50μg/mL的BWE即可有效改善氧化損傷下HIT-T15細胞的生存率(本實驗中，經樣品處理后氧化損傷組細胞生存率大于80%視為對氧化損傷有改善作用)。

2.3 BWE對HIT-T15細胞胰島素分泌能力的影響

以50μg/mL的BWE處理HIT-T15細胞48h后，觀察其對胰腺細胞胰島素分泌能力的影響，結果如圖3A示。BWE不僅可促進正常狀態下HIT-T15細胞胰島素的分泌，同時也可改善氧化應激損傷(50μmol/L SIN-1處理)所致胰腺細胞胰島素分泌能力的降低。此外，在細胞分子調控層面上，BWE也可降低胰島素分泌信號通路中負調節因子絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt蛋白的表達(圖3 B)，進而促進細胞胰島素的分泌[12]。

圖3 BWE對HIT-T15細胞胰島素分泌量和Akt蛋白表達的影響Fig.3 Effect of BWE on insulin secretion and Akt expression in HITT15 cells

2.4 BWE抑制氧化損傷而造成的胰腺細胞的凋亡

以 SIN-1 (50μmol/L)處理HIT-T15細胞后，50μg/mL BWE孵育48h，檢測細胞線粒體膜電位改變程度和抗凋亡蛋白質Bcl-2表達。如圖4A所示，BWE可緩解氧化損傷所致胰腺細胞凋亡時細胞線粒體膜電位的下降，維持線粒體膜的完整性，同時也可增強細胞內抗凋亡蛋白質Bcl-2的表達量(圖4B)從而遏制細胞凋亡進程[13]。

圖4 BWE對HIT-T15細胞內線粒體膜電位改變和Bcl-2蛋白表達的影響Fig.4 Effect of BWE on MMP change and Bcl-2 protein expression in HIT-T15 cells

3 結 論

體外研究表明，大葉紫薇葉有很好的抗氧化活性[14-15]。近年來，隨著對2型糖尿病的深入研究，自由基引發的氧化應激反應所導致的胰腺細胞凋亡被認為是糖尿病的主要病因之一。本實驗結果提示：大葉紫薇葉水提取物可抑制自由基所致氧化損傷所引起的細胞凋亡，其可能的機制是上調細胞內抗凋亡蛋白質Bcl-2的表達量。而Bcl-2蛋白可通過維持細胞線粒體的跨膜電位(即維持細胞線粒體膜的完整性)，進而抑制凋亡過程中線粒體途徑的細胞色素C的釋放過程，最終抑制細胞凋亡的發生[13]。另一方面，大葉紫薇葉水提物還可下調Akt蛋白的表達量，抑制其在胰島素分泌信號通路中的負向調節作用，進而促進胰島素的分泌。為大葉紫薇葉作為一種天然抗糖尿病藥物提供了分子層面上的依據。

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Protective Effect of Water Extract from Lagerstroemia specious L. Leaves on Oxidation-damaged HIT-T15 Pancreatic Cells

SONG Jia-le
(Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Pusan 609735, South Korea)

In this study, the protective effect of water extract from Lagerstroemia specious L. (Banaba) (BWE) on insulin secretion in oxidation-damaged HIT-T15 pancreatic cells was explored. Insulin secretion was determined by ELISA assay, and the BWE-induced insulin secretion capability was evaluated by Western-blotting. The anti-apoptotic capability of BWE was analyzed by mitochondria membrane potential (MMP) change and Bcl-2 protein expression. Results indicated that BWE could enhance insulin secretion and inhibit oxidative stress-induced cell apoptosis in HIT-T15 pancreatic cells.

Lagerstroemia specious L.；oxidation-damaged；anti-apoptosis；insulin secretion

R931.71

A

1002-6630(2011)03-0238-03

2010-06-11

宋家樂(1983—)，男，博士研究生，研究方向為分子營養學、植物化學。E-mail：bio.paul@hotmail.com