慢性阻塞性肺疾病患者支氣管黏膜活檢標本中 HO-1和 iNOS的表達

李巧榮 吳大瑋 楊 蕾 韓 進 (山東大學齊魯醫院加強醫療科,山東 濟南 500)

氧化應激反應在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的發病過程中起到重要作用〔1〕。炎癥和氧化應激可以刺激細胞內血紅素氧化酶-1(HO-1)和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的表達〔2〕。HO-1的降解產物具有抗氧化活性,HO-1還可直接上調細胞外過氧化物歧化酶(ec-SOD)表達,從而對肺臟有保護功能〔3,4〕;而 iNOS可產生過高的NO,使細胞的氧化還原電位轉向更強的氧化狀態;同時,NO與煙草中的超氧陰離子反應生成過氧亞硝酸離子和過氧亞硝酸鹽,前者為強氧化劑,后者有細胞毒作用〔5〕。目前對于不同嚴重程度、穩定期或急性加重期 COPD患者肺組織 HO-1表達水平升高或降低仍有爭議〔6,7〕,研究方法也主要是通過誘導痰、支氣管肺泡灌洗液、手術切除標本進行〔6～8〕,對于活體支氣管黏膜標本進行研究的報道少見。因此,本文經支氣管鏡鉗取COPD患者支氣管黏膜,觀察 HO-1和 iNOS的表達變化。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 在山東大學齊魯醫院門診或病房因肺部占位病變行支氣管鏡檢查的患者 28例,根據是否吸煙和肺功能檢查結果將其分為 3組:(1)吸煙伴 COPD組 9例,(2)吸煙肺功能正常組 9例(FEV1≥70%預計值);(3)不吸煙肺功能正常組10例。各組研究對象臨床指標見表 1。吸煙兩組之間的吸煙指數及三組患者在 FEV 1、年齡和性別方面的比較均無統計學差異。所有入選的 COPD患者均為穩定期,符合中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中的診斷標準〔9〕。所有患者在術前 3～5 d內均進行了CT檢查、常規肺功能檢查和支氣管舒張試驗,排除肺間質纖維化、支氣管擴張等其他影響肺功能的疾病。電子支氣管鏡黏膜活檢時間均在上午 8:00～10:00。

1.2 黏膜取材 術前 10～12 h禁食,術前 15 min霧化吸入2%利多卡因行氣道麻醉。仰臥位,給予鼻塞吸氧和心電監護,支氣管鏡通過鼻腔進入氣道,用活檢鉗取肺腫塊對側(健側)肺上/下葉(中間)、中/下葉支氣管間脊黏膜。活檢組織立刻放入多聚甲醛中固定、梯度酒精脫水、透明后石蠟包埋,做 2μm厚切片備免疫組化用。

1.3 免疫組化染色 用抗生素蛋白-生物素-過氧化物酶(ABC)法行細胞因子免疫組化染色,HO-1和iNOS為兔抗人多克隆抗體(購自北京中山生物技術有限公司),HO-1為即用型、iNOS為濃縮型(所用濃度為 1∶200)。將石蠟切片烘烤脫蠟至水,0.01mmol/L枸櫞酸鈉高壓 10 min,進行抗原修復,室溫冷卻后 3%過氧化氫浸泡 10 min,10%山羊血清封閉 15 min,然后加一抗 4℃過夜,加二抗,37℃孵育 30 min,DAB顯色,蘇木素復染,脫水透明,樹膠封片。HO-1和 iNOS均在胞質中表達,在顯微鏡 400倍下用全自動圖像分析系統對陽性染色進行分析,測定兩者的平均吸光度值,隨機測定 4個高倍視野后計算平均值,作為該切片的代表值。

1.4 統計學分析 用SPSS11.5統計軟件進行數據處理,所有數據以±s表示。各組免疫組化結果之間的比較采用兩樣本均數 t檢驗。HO-1和 iNOS及與 FEV1的相關性采用 Pearson相關分析。

2 結 果

2.1 免疫組化染色結果

2.1.1 HO-1的表達 HO-1在吸煙伴 COPD組患者氣管黏膜的上皮細胞、巨噬細胞均呈強陽性表達,吸煙肺功能正常組表達增強,不吸煙肺功能正常組弱表達。見圖 1。HO-1在吸煙伴COPD組(0.156±0.036)和吸煙肺功能正常組(0.147±0.049)的表達均明顯高于不吸煙肺功能正常組(0.094±0.043)(P＜0.01),吸煙兩組無統計學差異(P＞0.05)。

表1 研究對象臨床資料(±s)

表1 研究對象臨床資料(±s)

與吸煙肺功能正常組比較:1)P＜0.01,與不吸煙肺功能正常組比較:2)P＜0.01

吸煙伴 COPD組 9 7/2 62.4±8.9 450.0±111.8 75.4±17.8 65.4±6.41)2)吸煙肺功能正常組 9 8/1 57.0±8.8 672.2±304.2 85.9±14.8 80.6±6.1不吸煙肺功能正常組 10 8/2 54.8±9.4 - 98.0±16.0 86.7±10.0

圖1 各組 HO-1和 iNOS的免疫組化染色(DAB,×400)

2.1.2 iNOS的表達 iNOS在吸煙伴 COPD組氣管黏膜上皮細胞和巨噬細胞呈強陽性表達,在吸煙肺功能正常組呈陽性表達,在不吸煙肺功能正常組呈弱陽性表達。見圖 1。iNOS在吸煙伴 COPD組的表達(0.188±0.030)明顯高于不吸煙肺功能正常組(0.159±0.034,P＜0.01),吸煙肺功能正常組(0.176±0.053)雖然高于不吸煙肺功能正常組(0.159±0.034),但兩者之間無統計學差異(P＞0.05)。

2.2 HO-1與 iNOS的表達與肺功能的關系 氣管黏膜 HO-1與 iNOS的表達無明顯的相關性(r=0.046,P＞0.05),HO-1在氣管黏膜中平均吸光度值與FEV 1呈負相關(r=-0.558,P＜0.05)。見圖 2。

圖2 HO-1平均吸光度值與 FEV 1的相關性

3 討 論

HO是一種可誘導的抗氧化酶,目前發現有 3種同工酶,包括誘導型 HO-1、結構型 HO-2和 HO-3〔10〕。 目前發現 HO-2的表達和活性不受氧化應激等誘導,HO-3缺乏活性,其生物學特性和功能尚不清楚,而 HO-1是迄今為止發現的生物體內最容易被誘導產生的抗氧化酶。HO-1可以催化含鐵血紅素產生膽紅素、鐵蛋白和一氧化碳。研究發現膽紅素是一種有效的抗氧化劑,體外實驗證實膽紅素能清除氧自由基,一氧化碳對炎癥細胞或外源性氧化劑產生的氧自由基導致的肺損傷有保護作用〔11〕。

近年的研究還進一步發現,HO-1對于 COPD發病的多個病理和病理生理環節均有保護作用。Shinohara〔12〕的動物實驗證明,腺病毒轉基因小鼠肺組織 HO-1高表達可減低肺泡灌洗液中性粒細胞、TNF-α、IL-6和膠質細胞源性趨化因子水平,升高抗炎性因子 Il-10水平,并減輕彈性蛋白酶導致的肺氣腫程度;Lee等〔13〕在人氣道平滑肌細胞體外培養中加入 HO-1誘導劑鈷原卟啉(cobalt protoporphyrin),或用攜帶人 HO-1基因的重組腺病毒感染平滑肌細胞,高表達的 HO-1通過下調氧化應激反應、黏附分子和 IL-6減輕了 TNF-α介導的氣道炎癥,抑制了 TNF-α誘導的 NF-κB活性,以及 TNFR1/c-Src/p47phox復合物的形成;HO-1可誘導牛肺動脈(BPA)細胞外過氧化物酶(ecSOD)表達增加,從而減輕低氧性肺血管收縮(HPV)〔3〕;Almolki等〔14〕報道 HO-1可抑制香煙暴露導致的氣道黏液高分泌。

盡管 HO-1作為炎癥和氧化應激的可誘導酶,但是,關于臨床COPD患者肺和氣道組織HO-1表達水平是升高抑或是降低報道結果不一。大部分研究〔6,8〕認為在 COPD患者肺和氣道組織中HO-1表達增加,但也有部分作者報道 HO-1在COPD手術切除標本中表達降低〔7〕。本文通過支氣管活檢標本的研究表明,吸煙伴COPD組和吸煙肺功能正常組氣管黏膜中 HO-1的表達均較不吸煙肺功能正常組增高,表明吸煙是誘導氣道黏膜組織高表達 HO-1的重要原因。

以往少有肺功能與HO-1表達水平之間關系的報道。本研究發現,支氣管黏膜中HO-1的表達水平與 FEV1呈負相關,提示隨著 COPD程度加重,氣道黏膜 HO-1表達增加。Hogg等〔15〕曾報道,隨著COPD患者 GOLD分級增加,氣道黏膜浸潤的巨噬細胞和嗜中性粒細胞數也相應增加。根據生理學規律,隨著炎癥程度加重,其誘導 HO-1表達的水平也可能隨之增高;但是,HO-1的抗氧化功能并不足以對抗炎癥加重或長期病程對氣道的氧化損傷作用〔6〕。曾有報道,在嚴重 COPD病人肺泡巨噬細胞內 HO-1表達減少,認為存在 HO-1基因多態性現象,使部分患者對氧化損傷的防御機制降低〔16〕。

iNOS主要由巨噬細胞產生,可以催化L-精氨酸生成一氧化氮(NO),過高的 NO可以造成組織細胞的氧化損傷〔5,17〕,活化基質金屬蛋白酶,促進肺氣腫的產生〔18〕。目前研究已經證明,COPD患者誘導痰液iNOS的表達升高,呼出氣中的 NO含量增加〔19〕。本研究也表明,COPD病人氣管黏膜中 iNOS的表達增強。但是,吸煙肺功能正常組 iNOS的表達盡管較不吸煙肺功能正常組增高,但無統計學差異。這在一定程度上提示,iNOS在COPD病人黏膜內表達增高可能不單純是由于吸煙引起的,吸煙導致肺臟的炎癥程度與黏膜內 iNOS表達之間的關系尚需要進一步的研究。

氧化/抗氧化機制的相互制約是一個復雜的過程。氧化應激可活化上皮細胞和炎癥細胞內的轉錄因子,使編碼 HO-1和iNOS的基因表達上調〔18〕。HO-1可以通過降解血紅素下調 iNOS的表達,而 NO有穩定 HO-1信使核糖核酸的作用,從而可以上調 HO-1的表達〔20〕。本實驗研究結果顯示 COPD患者支氣管黏膜中 HO-1和iNOS表達無明顯相關性,不能確定這是否與本試驗對象多為輕、中度 COPD病例有關,也不清楚重度COPD病例支氣管黏膜中兩者之間的相關關系。

本研究結果表明,氣道黏膜 HO-1表達與氣流受限程度正相關,這在一定程度上提示炎癥和氧化應激誘導的抗氧化保護機制是不充分的,進一步探索可用于臨床的強效HO-1活化劑可能是 COPD治療研究的一個潛在方向。

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