S100A4基因表達與胃癌生物學行為的關(guān)系

陶致侃 (沈陽醫(yī)學院沈洲醫(yī)院普外科,遼寧 沈陽 110002)

S100A 4是S100家族中研究最多的具有促腫瘤作用的蛋白,通過降低腫瘤細胞間黏附力、促進細胞外基質(zhì)的降解和重塑、增加腫瘤細胞的運動能力、抑制細胞凋亡和促進細胞異常增殖、促進血管生成等途徑,參與細胞的異常增殖、惡變、浸潤轉(zhuǎn)移等腫瘤發(fā)生、發(fā)展中不同階段的病理過程,進而發(fā)揮其促腫瘤作用〔1〕。在多數(shù)腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、膽囊癌、甲狀腺癌中,S100A4的表達均高于對應(yīng)正常組織〔1,2〕。在此,本文采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)法檢測轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 S100A 4在胃癌病灶中的表達,探討其表達水平與胃癌生物學行為和病情進展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集本院普外科 2006年 3月至 2009年 5月 45例原發(fā)性進展期胃癌切除標本。所有患者術(shù)前未經(jīng)放療或化療,病灶均為單發(fā)。根據(jù)其組織學類型和分化程度,將高分化、中分化腺癌 15例歸入分化型,低分化腺癌、黏液腺癌、未分化癌、印戒細胞癌等 30例歸入未分化型〔3〕;浸潤深度按固有肌層(mp)～漿膜下(ss)和穿透漿膜(se)～侵及周圍臟器(si)分為兩組;TNM分期參照 1997年 UICC第 5版分期標準〔4〕。

主要試劑:細胞總 RNA提取試劑 TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Reverse Transcription System A 3500、TaqDNA合成酶、PCR反應(yīng)緩沖液(Romega公司),S100A 4及內(nèi)對照 β-actin的PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 手術(shù)標本離體后,立即在腫瘤對側(cè)剖開胃壁,在腫瘤生長良好,無壞死區(qū)域取瘤組織一塊,另于標本距病灶最遠處取黏膜組織作為對照。將組織盛于經(jīng)高壓滅菌的Eppendorf管中,置入 -80℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 細胞總 RNA的提取 取出保存的沉渣,按照 TRIzol試劑說明書進行細胞總 RNA提取。將提取的RNA溶于 10μl的無 RNA酶水中,于 -80℃冰箱保存。

1.2.3 RT-PCR檢測 取 1μl RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的比例加樣,進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為:42℃,60 min;99℃,5 min;4℃,5 min。

以 cDNA為模板進行 RCR擴增。S100A 4引物序列:5′-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3′和 5′-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3′,產(chǎn)物 片 段 277 bp;內(nèi) 對 照 β-actin引 物 序 列:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′和 5′-CTCCTTAATGTCACGCACG ATTTC-3′,產(chǎn)物片段 513 bp。 PCR反應(yīng)條件為:變性:95℃,45 s;退火:57℃,45 s;延伸:72℃,1 min;共 30個循環(huán)。

取 PCR產(chǎn)物 10μl行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以自動成像儀攝下電泳圖像;采用Gel-work-ID軟件分析圖像,計算目的基因表達的相對定量值。

1.3 統(tǒng)計學方法 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度不同的各組間均數(shù)比較采用方差分析,其余各組間均數(shù)比較采用 t檢驗。數(shù)據(jù)處理使用SPSS10.0版軟件。

2 結(jié) 果

2.1 S100A4 mRNA表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系 45例病灶組織均檢測到 S100A4 mRNA表達,黏膜組織表達者僅 28例,且表達水平遠低于病灶。S100A 4 mRNA表達水平與胃癌的大體類型、浸潤深度(P＜0.01)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度(P＜0.05)密切相關(guān)。見表 1。

2.2 S100A4 mRNA表達與胃癌 TNM分期的關(guān)系 TNMⅢ/Ⅳ期病灶 19例,其 S100A 4 mRNA表達水平(0.545 9±0.136 0)明顯高于Ⅰ/Ⅱ期病灶(26例)的水平(0.677 8±0.148 1)(P＜0.01),即隨著病期進展,S100A4表達水平明顯增高。

表1 S100A 4 mRNA表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

S100A 4又稱 CAPL、p9ka、mts1等,是 1989年由 Sbralidze從高轉(zhuǎn)移性小鼠乳癌細胞中克隆的一種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,1992年克隆了人類 S100A 4基因。該基因位于染色體 1q21,全長2 837 bp,其編碼產(chǎn)物為 101個氨基酸的蛋白質(zhì),屬 Ca2+結(jié)合蛋白 S100家族的成員。近年來的研究表明,S100A4表達與多種惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān),被認為是反映腫瘤預后不良的分子標志物之一〔5～7〕。有學者將 S100A 4基因轉(zhuǎn)染至大鼠良性乳腺上皮細胞或侵襲轉(zhuǎn)移力較低的人乳癌細胞系MCF-7后,良性上皮獲得了轉(zhuǎn)移表型,癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力則顯著增強〔8,9〕;通過反義寡核苷酸、RNA干擾等方法抑制 S100A4表達,可明顯降低高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移率〔10～12〕。目前認為,S100A 4能增強基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)活性,下調(diào)其組織抑制因子 TIMPs的合成,從而促進細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解和腫瘤浸潤;還能通過影響細胞骨架動力學,上調(diào)局部黏附分子表達,改變ECM結(jié)構(gòu)等機制,增強瘤細胞的運動和黏附能力〔13〕。可見,S100A 4通過多種機制,在多階段促進了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤生物學行為的重要標志。就胃癌而言,其最常見的轉(zhuǎn)移方式為淋巴轉(zhuǎn)移,而浸潤深度和大體類型分別反映了癌灶在胃壁內(nèi)侵襲的深度和廣度。本研究發(fā)現(xiàn),S100A 4mRNA在 BorrmannⅢ/Ⅳ和侵入漿膜層(se～si)的胃癌病灶中呈現(xiàn)明顯高表達,而且隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的進展,表達水平也逐漸增高。此結(jié)果提示,S100A 4表達與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移行為密切相關(guān),其高表達是癌灶高侵襲力的象征。

另一方面,腫瘤 TNM分期是國際公認的描述病情進展、判斷病人預后的重要參照。本研究中,隨著 TNM分期的進展,S100A 4的表達呈上升趨勢;TNMⅢ/Ⅳ期病例的表達水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期。可見,S100A 4 mRNA表達水平在一定程度上可以反映胃癌的病程進展和患者的預后情況。

綜上所述,S100A4的高表達與胃癌的惡性行為和不良預后密切相關(guān)。以該基因為靶點的基因阻斷治療可能會產(chǎn)生良好的效果,有待于進一步的研究。

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