S100A4基因表達與胃癌生物學行為的關系

陶致侃 (沈陽醫學院沈洲醫院普外科,遼寧 沈陽 110002)

S100A 4是S100家族中研究最多的具有促腫瘤作用的蛋白,通過降低腫瘤細胞間黏附力、促進細胞外基質的降解和重塑、增加腫瘤細胞的運動能力、抑制細胞凋亡和促進細胞異常增殖、促進血管生成等途徑,參與細胞的異常增殖、惡變、浸潤轉移等腫瘤發生、發展中不同階段的病理過程,進而發揮其促腫瘤作用〔1〕。在多數腫瘤如乳腺癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、膽囊癌、甲狀腺癌中,S100A4的表達均高于對應正常組織〔1,2〕。在此,本文采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測轉移相關基因 S100A 4在胃癌病灶中的表達,探討其表達水平與胃癌生物學行為和病情進展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集本院普外科 2006年 3月至 2009年 5月 45例原發性進展期胃癌切除標本。所有患者術前未經放療或化療,病灶均為單發。根據其組織學類型和分化程度,將高分化、中分化腺癌 15例歸入分化型,低分化腺癌、黏液腺癌、未分化癌、印戒細胞癌等 30例歸入未分化型〔3〕;浸潤深度按固有肌層(mp)～漿膜下(ss)和穿透漿膜(se)～侵及周圍臟器(si)分為兩組;TNM分期參照 1997年 UICC第 5版分期標準〔4〕。

主要試劑:細胞總 RNA提取試劑 TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司),逆轉錄試劑盒 Reverse Transcription System A 3500、TaqDNA合成酶、PCR反應緩沖液(Romega公司),S100A 4及內對照 β-actin的PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 手術標本離體后,立即在腫瘤對側剖開胃壁,在腫瘤生長良好,無壞死區域取瘤組織一塊,另于標本距病灶最遠處取黏膜組織作為對照。將組織盛于經高壓滅菌的Eppendorf管中,置入 -80℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 細胞總 RNA的提取 取出保存的沉渣,按照 TRIzol試劑說明書進行細胞總 RNA提取。將提取的RNA溶于 10μl的無 RNA酶水中,于 -80℃冰箱保存。

1.2.3 RT-PCR檢測 取 1μl RNA,參照逆轉錄試劑盒說明書的比例加樣,進行逆轉錄反應。反應條件為:42℃,60 min;99℃,5 min;4℃,5 min。

以 cDNA為模板進行 RCR擴增。S100A 4引物序列:5′-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3′和 5′-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3′,產物 片 段 277 bp;內 對 照 β-actin引 物 序 列:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′和 5′-CTCCTTAATGTCACGCACG ATTTC-3′,產物片段 513 bp。 PCR反應條件為:變性:95℃,45 s;退火:57℃,45 s;延伸:72℃,1 min;共 30個循環。

取 PCR產物 10μl行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以自動成像儀攝下電泳圖像;采用Gel-work-ID軟件分析圖像,計算目的基因表達的相對定量值。

1.3 統計學方法 淋巴結轉移程度不同的各組間均數比較采用方差分析,其余各組間均數比較采用 t檢驗。數據處理使用SPSS10.0版軟件。

2 結 果

2.1 S100A4 mRNA表達與胃癌臨床病理因素的關系 45例病灶組織均檢測到 S100A4 mRNA表達,黏膜組織表達者僅 28例,且表達水平遠低于病灶。S100A 4 mRNA表達水平與胃癌的大體類型、浸潤深度(P＜0.01)及淋巴結轉移程度(P＜0.05)密切相關。見表 1。

2.2 S100A4 mRNA表達與胃癌 TNM分期的關系 TNMⅢ/Ⅳ期病灶 19例,其 S100A 4 mRNA表達水平(0.545 9±0.136 0)明顯高于Ⅰ/Ⅱ期病灶(26例)的水平(0.677 8±0.148 1)(P＜0.01),即隨著病期進展,S100A4表達水平明顯增高。

表1 S100A 4 mRNA表達與胃癌臨床病理因素的關系

3 討 論

S100A 4又稱 CAPL、p9ka、mts1等,是 1989年由 Sbralidze從高轉移性小鼠乳癌細胞中克隆的一種轉移相關基因,1992年克隆了人類 S100A 4基因。該基因位于染色體 1q21,全長2 837 bp,其編碼產物為 101個氨基酸的蛋白質,屬 Ca2+結合蛋白 S100家族的成員。近年來的研究表明,S100A4表達與多種惡性腫瘤的侵襲、轉移能力呈正相關,被認為是反映腫瘤預后不良的分子標志物之一〔5～7〕。有學者將 S100A 4基因轉染至大鼠良性乳腺上皮細胞或侵襲轉移力較低的人乳癌細胞系MCF-7后,良性上皮獲得了轉移表型,癌細胞的侵襲轉移能力則顯著增強〔8,9〕;通過反義寡核苷酸、RNA干擾等方法抑制 S100A4表達,可明顯降低高轉移性腫瘤細胞的侵襲、轉移率〔10～12〕。目前認為,S100A 4能增強基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)活性,下調其組織抑制因子 TIMPs的合成,從而促進細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的降解和腫瘤浸潤;還能通過影響細胞骨架動力學,上調局部黏附分子表達,改變ECM結構等機制,增強瘤細胞的運動和黏附能力〔13〕。可見,S100A 4通過多種機制,在多階段促進了腫瘤的侵襲和轉移。

侵襲和轉移是惡性腫瘤生物學行為的重要標志。就胃癌而言,其最常見的轉移方式為淋巴轉移,而浸潤深度和大體類型分別反映了癌灶在胃壁內侵襲的深度和廣度。本研究發現,S100A 4mRNA在 BorrmannⅢ/Ⅳ和侵入漿膜層(se～si)的胃癌病灶中呈現明顯高表達,而且隨著淋巴結轉移程度的進展,表達水平也逐漸增高。此結果提示,S100A 4表達與胃癌的侵襲和轉移行為密切相關,其高表達是癌灶高侵襲力的象征。

另一方面,腫瘤 TNM分期是國際公認的描述病情進展、判斷病人預后的重要參照。本研究中,隨著 TNM分期的進展,S100A 4的表達呈上升趨勢;TNMⅢ/Ⅳ期病例的表達水平明顯高于Ⅰ/Ⅱ期。可見,S100A 4 mRNA表達水平在一定程度上可以反映胃癌的病程進展和患者的預后情況。

綜上所述,S100A4的高表達與胃癌的惡性行為和不良預后密切相關。以該基因為靶點的基因阻斷治療可能會產生良好的效果,有待于進一步的研究。

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