改變血紅素加氧酶-1水平對糖尿病大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)及腎功能的影響

邢邯英 野戰(zhàn)鷹 張冬會 付玲娣 裴華穎 (河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點實驗室,河北 石家莊 050051)

氧化應(yīng)激在糖尿病腎病(DN)的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用,高血糖誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生增多是糖尿病(DM)血管并發(fā)癥包括 DN在內(nèi)發(fā)生的主要因素。血紅素加氧酶-1(HO-1)被證實是重要的生理性氧自由基清除劑,體外實驗表明,在嚴(yán)重缺氧情況下,其抗脂質(zhì)過氧化的能力優(yōu)于維生素 E,被認(rèn)為是最佳的抗自由基物質(zhì)。可見 HO-1是細(xì)胞的一種內(nèi)源性保護(hù)蛋白,那么激活的HO-1通路是否可以起到對抗 DM腎臟氧化損傷的作用呢?本實驗復(fù)制了 DM大鼠模型,觀察 HO-1的誘導(dǎo)劑正鐵血紅素(Hemin)和其抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)對 DN大鼠腎功能和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響,探討HO-1與 DN的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 鏈脲佐菌素、Hemin、ZnPP均購自美國 Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品;血清總抗氧化能力(TAOC)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物試劑公司。PCR擴(kuò)增體系為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DM大鼠模型的制備和分組 將雄性 SD大鼠隨機(jī)分成 4組:①生理溶劑對照組;②DM組:大鼠按 50 mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素以誘導(dǎo) DM,于模型成功后 5 w,10 w和15 w處死動物;③Hemin組:確認(rèn) DM大鼠模型成功后每日腹腔注射 Hemin 30μmol/kg,連續(xù) 5 w;④ZnPP組:確認(rèn)模型成功后腹腔注射 ZnPP 10μmol/kg,連續(xù) 5 w。

1.2.2 血清 TAOC和 MDA含量測定 全血 4℃離心3 000 r/min,10 min。取血清分裝待測。按試劑盒說明操作。

1.2.3 尿白蛋白排泄率(UEA)檢測 留取 24 h尿液-20℃冰箱保存待測 UEA。

1.2.4 RT-PCR技術(shù)檢測腎臟 HO-1、TNF mRNA表達(dá) 取各組大鼠腎組織,Trizol一步法提取總 RNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成 cDNA。HO-1的上、下游引物分別為:5′-CTG GAA GAG GAG ATA GAG CGAA-3′,3′-TCTTAG CCT CTT CTG TCA CCCT-5′,擴(kuò)增產(chǎn)物全長 433 bp;TNF-α的上、下游引物分別為:上游 5′-CGA GTGACA AGCCCG TAGCC-3′;下游為 :5′-GGA TGA ACA CGC CAG TCG CC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物全長 255bp。以 β-actin作為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖電泳,UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。用目的基因的吸光度與β-actin吸光度的比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。

2 結(jié) 果

2.1 血清 TAOC與 MDA含量的變化 與對照組血清 TAOC相比,5、10、15 w DM大鼠血清 TAOC均下降,并且有時間依賴性(P均 ＜0.01);MDA含量則逐步上升,10、15 w DM大鼠MDA含量較對照組明顯增高(P＜0.01);Hemin組血清TAOC雖仍低于對照組水平(P＜0.05),但是與 DM組大鼠相比明顯增高(P＜0.05);而給予 ZnPP后 DM大鼠 MDA含量進(jìn)一步增加,TAOC繼續(xù)降低,與 DM組相比均有顯著差異(P＜0.05)。見表 1。

表1 各組大鼠 TAOC及 MDA含量的變化(±s)

表1 各組大鼠 TAOC及 MDA含量的變化(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05,2)P＜0.01;與 5 w DM組比較:3)P＜0.05

組別 TAOC(U/ml) MDA(nmol/L)對照組 8.84±0.81 4.56±0.28 DM組 5 w組 6.24±0.872) 5.63±0.52 10 w組 5.32±0.912) 6.82±0.472)15 w組 4.02±0.912) 8.13±0.892)Hemin組 7.22±0.121)3) 5.53±0.52 ZnPP組 4.33±0.442)3) 7.51±0.492)3)

圖1 各組 TNF-α及 HO-1m RNA的 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 UEA比較 與對照組相比,5、10、15 w DM大鼠 UEA均上升(P均 ＜0.01),并隨病程延長而加重;Hemin組與 DM 5 w組相比已有下降趨勢,但尚無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);ZnPP組大鼠 UEA明顯增高,與對照組及DM 5 w組相比,均有顯著差異(P＜0.01)。

2.3 HO-1與 TNF-αmRNA在各組腎臟組織的表達(dá) 見圖 1。對照組 HO-1/β-actin的 IOD比值為(46.52±11.56)%,病程5 w的DM大鼠 HO-1表達(dá)明顯上調(diào),IOD比值達(dá)到(67.10±12.18)%,兩者相比有顯著差異(P＜0.01);Hemin組 HO-1表達(dá)量為(102.17±9.04)%較對照組和 DM組均升高(P＜0.01)。ZnPP組 HO-1表達(dá)量為(62.96±15.11)%與 DM組無差異。與對照組 TNF-αIOD值(21.13±5.69)%相比較,DM組 TNF-α/β-actin的 IOD比值明顯增高(49.42±4.17)%,Zn-PP組(55.71±12.83)%與 DM 5 w組 TNF-α表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異,但是應(yīng)用 Hemin后 DM大鼠腎臟組織 TNF-α表達(dá)減少〔(32.89±7.45)%,P＜0.01〕。

3 討 論

本實驗成功復(fù)制了DM大鼠模型,在病程早期大鼠就表現(xiàn)了典型的“三多一少”癥狀,即多飲、多尿、多食和體重減少;5 w DM大鼠 UEA明顯高于對照組,形成腎臟損傷,并隨病程時間的延長,UEA升高程度增加,表明DN損傷加重。

HO-1可被多種氧化應(yīng)激因素所誘生(如內(nèi)毒素、高氧、低氧、紫外線、重金屬和血紅素等)〔1～3〕,是目前所知最易受誘導(dǎo)的酶之一,所以有研究者認(rèn)為 HO-1可能是機(jī)體的一種自身保護(hù)性蛋白,是組織細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激的重要組成部分。近來有關(guān) HO-1與 DM及其并發(fā)癥的研究備受重視,并已取得一些成果。Hayashi等〔4〕已證實 DM大鼠腎小球上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)腔 HO-1mRNA和蛋白表達(dá)增高,應(yīng)用維生素 E或丙丁酚進(jìn)行治療的 DM大鼠的 HO-1表達(dá)和正常無異,活性氧的含量變化與 HO-1的變化一致,提示HO-1對抗DM腎病的氧化損傷。我們正是基于以上的研究成果,將 HO-1與 DN的研究繼續(xù)深入。

本實驗在 DM大鼠病程的中晚期觀察到血清 MDA含量明顯增加,這是體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)造成脂質(zhì)過氧化的證據(jù),同時在病程早期即發(fā)現(xiàn)了血清TAOC下降,說明機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能也已受損,以上結(jié)果強(qiáng)烈提示抗氧化治療的必要性,且應(yīng)用Hemin后可增加 DM大鼠的 TAOC,降低 MDA水平;UEA有下降趨勢,雖沒有統(tǒng)計學(xué)意義,但 UEA是判斷 DN的敏感指標(biāo),UEA的變化說明腎臟損傷有緩解。因觀察時間有限,有可能隨著時間的延長會有統(tǒng)計學(xué)結(jié)果的顯示。而在連續(xù)給予HO-1抑制劑 ZnPP后 TAOC下降,MDA含量和 UEA在 DM早期就增高,同樣提示抑制HO-1可以損害機(jī)體的抗氧化系統(tǒng),加重腎臟病變和功能紊亂。TNF-α是一重要的前炎性因子,本實驗中觀察到應(yīng)用 Hemin可以降低TNF-α的表達(dá)水平,但這種作用是繼發(fā)于 HO-1對氧化應(yīng)激的削弱還是對 TNF-α的直接作用仍有待進(jìn)一步的研究。我們推測Hemin預(yù)處理可以使HO-1表達(dá)顯著增強(qiáng),延緩DN的進(jìn)程。結(jié)合Hemin對腎臟功能的保護(hù),抗氧化途徑應(yīng)是 HO-1對抗DN功能障礙的機(jī)制之一。

本部分實驗僅觀察到改變HO-1水平對DM大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)及腎功能的影響,但缺乏直接的證據(jù)證實這種保護(hù)作用是由 HO-1分解血紅素后何種代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的或是各種產(chǎn)物的綜合作用,深入研究各產(chǎn)物對 DM病變發(fā)生、發(fā)展的作用將是今后研究的方向。

1 徐金金,王 龍.異丙酚對大鼠心肌細(xì)胞氧化損傷時血紅素加氧酶-1表達(dá)的影響〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報,2009;38(6):760-3.

2 Carraway,MS,Ghio AJ,Carter JD,et al.Expression of heme oxygenase-1 in the lung in chronic hypoxia〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2000;278(4):L806-12.

3 Lee,PJ,Alam J,Wiegand GW,et al.Overexpression of heme oxygenase-1 expression in human pulmonary epithelial cells results in cell growth arrest and increased resistance to hyperoxia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(19):10393-8.

4 Hayashi K,Haneda M,Koya D,et al.Enhancement of glomerular heme oxygenase-1 expression in diabetic rats〔J〕.Diabetes Res Clin Pract,2001;52(2):85-96.