套式PCR與血清學方法用于檢測肺炎支原體感染的對比研究

劉雪梅 唐正宇 謝良依

套式PCR與血清學方法用于檢測肺炎支原體感染的對比研究

劉雪梅 唐正宇 謝良依

目的 比較基于16SrRNA的套式PCR與血清學方法對肺炎支原體(Mp)的檢出情況。方法 獲取醫(yī)院呼吸內(nèi)科96例呼吸道標本，設(shè)計針16SrRNA特異性引物,用套式PCR法擴增。同時獲取雙份血清標本檢測Mp抗體,比較兩種方法的陽性率。結(jié)果 套式PCR對Mp的檢出率為22.9%,雙份血清檢出率為18.75%,差異無統(tǒng)計學意義。單份血清檢出率為10.4%,套式PCR法對Mp的檢出率明顯高于單份血清試驗。84例發(fā)病早期患兒,套式PCR檢測出陽性69例,陽性率為82.14%,血清抗體陽性10例,陽性率為12.04%。經(jīng)統(tǒng)計學分析,P＜0.05。結(jié)論 套式PCR和血清學方法均能敏感快速檢測Mp感染,但對早期感染而言,套式PCR更有優(yōu)勢。

肺炎支原體;16SrRNA;套式PCR

肺炎支原體(Mp)是引起人類非典型性肺炎的常見病原體，好發(fā)于秋冬季，以兒童和青少年多見。本病臨床癥狀呈非特異性，與其他間質(zhì)性肺炎的病原體引起的肺炎很難區(qū)分。支原體細胞膜上與人體某些部位存在共同抗原，感染后可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體，從而繼發(fā)地引起全身多臟器損害及各種肺外并發(fā)癥。診斷支原體肺炎的手段雖然多，但迄今為止尚缺乏特異和敏感的診斷方法[1-2]。本文采用基于16SrRNA的套式PCR技術(shù)檢測肺炎患兒的Mp感染，同時結(jié)合血清抗體的微量板凝集試驗為對照，探討其在Mp分子診斷中的應(yīng)用價值。

1 研究對象與實驗方法

1.1 研究對象 以2010年3月～2010年12月于湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科病房住院的肺炎患兒為研究對象。據(jù)第7版《實用兒科學》的入選和剔除標準入選患兒共96例：男47例，女48例;年齡4月～14.5歲，平均年齡(6.2±2.5歲)。所有患兒均有不同程度的呼吸道感染臨床癥狀，并排除其他肺外感染性疾病。

1.2 標本采集 所有患兒在入院后24h內(nèi)完成。患兒漱口后，用無菌咽拭子擦拭患兒咽后壁，隨后放置于裝有1ml無菌生理鹽水的Ep管中，置于-70℃冰箱保供研究使用。同時抽取靜脈血lml低溫保存供抗體檢測用。另外每隔1w用同樣方法復(fù)查DNA以及血清抗體。

1.3 DNA提取與PCR引物設(shè)計 在上述標本于12000rpm下離心10min，去上清。沉淀加入50μlDNA裂解液(按《分子克隆實驗指南》第3版配制)，100℃煮沸10min，12000rpm離心10min，取上清備用。引物設(shè)計：16SrRNA外套引物：5’-AAG GAC CTG CAA GGG TTGT-3’(上游), 5’-CTC TAG CCATTA CCT GCTAA-3’(下游)。內(nèi)套引物：5’-CTC TAG CCA TTA CCT GCT AA-3’(上游), 5’-ACT CCT ACGGGAGCK：AGCAGTA-3’(下游)。

1.4 套式PCR反應(yīng) 第一輪反應(yīng)：95℃變性5min，隨后進入30個以下循環(huán)：94℃變性30s，54℃30s，72℃60s。最后一個循環(huán)結(jié)束后72℃延伸9min。第二輪反應(yīng)：取第一次反應(yīng)產(chǎn)物10μl為模版，加入第二套引物，退火溫度改為56℃，其余和第一輪反應(yīng)相同。每次反應(yīng)設(shè)立1個陽性對照、1個陰性對照。

1.5 Mp抗體檢測 原理為微量板凝集試驗，試劑盒購自日本富士REBIO公司。操作步驟按照試劑盒提供的說明書進行。若單份血清抗體滴度大于1:80或第二份血清與第一份血清相比抗體滴度升高4倍或以上者判為陽性。

1.6 統(tǒng)計學方法 所有資料采用x2檢驗，P＜0.05判定為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基于16SrRNA的套式PCR與抗體檢測陽性率情況 套式PCR對Mp的檢出率為22.9%(22/96)，雙份血清檢出率為18.75%(18/96)，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，x2=0.5053，P＞0.05。單份血清檢出率為10.4%(10/96)，套式PCR法對Mp的檢出率明顯高于單份血清微量板凝集試驗(x2=5.4，P＜0.05)。以雙份血清抗體滴度增高4倍為診斷Mp的“金標準”，套式PCR法的靈敏度為86.4%，特異度為91.3%。

2.2 發(fā)病早期兩種方法檢出率比較 在發(fā)病早期就診的患兒有84例，套式PCR檢測出陽性69例，陽性率為82.14%，血清抗體陽性10例，陽性率為12.04%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，x2=83.175，P＜0.05。

3 討論

鑒于Mp感染有可能引起嚴重的肺外并發(fā)癥，且其臨床癥狀與其他病原體引起的非典型性肺炎難以區(qū)分，尤其是以肺外癥狀為首發(fā)癥狀時，臨床上極易誤診，因此早期選擇快速敏感的診斷方法非常必要[1,3]。目前臨床上選用最多的是檢測Mp特異性抗體作為確診指標。對于嬰幼兒而言，因免疫系統(tǒng)發(fā)育不夠完善，因此僅憑抗體檢測不可避免存在假陰性。此外，因受時間的限制，從患者體內(nèi)獲取雙份血清也存在一定的困難。這些條件不同程度上使抗體檢測受到了一定的限制[4]。PCR技術(shù)自從開始應(yīng)用于臨床診斷以來，因其靈敏度高、特異性好，且不受集體免疫狀態(tài)的影響，已經(jīng)成為早期快速診斷Mp感染的方法。由此衍生的套式PCR敏感性得到了進一步提高[5]。

Mp的分子生物學診斷，靶基因選擇很重要。研究發(fā)現(xiàn)，以16SrRNA為靶基因比以黏附素P1基因敏感性更高，可在任何感染階段，尤其是血清學結(jié)果為陰性時更有效[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，在檢測Mp抗體的同時，采用套式PCR比較，結(jié)果顯示，二者檢出率無統(tǒng)計學意義。但套式PCR法能更早檢測出Mp，與國外報道一致。鑒于支原體內(nèi)16srRNA含量約為103拷貝，而支原體死亡后，其降解快于DNA，因此標本中16SrRNA陽性時相可能更接近支原體存活的時相[7]。

總之，兒童及嬰幼兒Mp的感染率較高，若伴有肺外并發(fā)癥時，部分患兒可能留有后遺癥。應(yīng)用套式PCR檢測Mp16SrRNA能早期快速診斷Mp感染，以便早期給予敏感的抗生素治療，從而降低各類后遺癥的發(fā)生。

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[3]牟紅梅,李俠,張燕妮.小兒肺炎支原體感染的肺外表現(xiàn)[J].當代醫(yī)學,2009,15(09):38-39.

[4]Mulholland S,Gavranich JB,Chang AB.Antibiotics for communityacquired lower respiratory tract infections secondary to Mycoplasma pneumoniae in children[J].Cochrane Database Syst Rev,2010(7):CD004875.

[5]Maheshwari M,Kumar S,Sethi GR,et al.Detection of Mycoplasma pneumoniae in children with lower respiratory tract infections[J].Trop Doct, 2011,41(1):40-42.

[6]Lin C,Li S,Sun H,et al.Nested PCR-linked capillary electrophoresis and single-strand conformation polymorphisms for detection of macrolideresistant Mycoplasma pneumoniae in Beijing,China[J].J Clin Microbiol, 2010,48(12):4567-4572.

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10.3969/j.issn.1009-4393.2011.18.102

410100 長沙市衛(wèi)生學校醫(yī)學基礎(chǔ)學科部 (劉雪梅 唐正宇) 410100 湖南省人民醫(yī)院檢驗科 (謝良依)