植物原生質體融合技術的研究進展

黃國文

(湖南科技學院 生命科學和化學工程學院，湖南 永州 425100)

植物原生質體融合技術的研究進展

黃國文

(湖南科技學院 生命科學和化學工程學院，湖南 永州 425100)

植物原生質體融合（protoplast fusion）技術能夠克服植物遠緣雜交不親和的障礙，實現遺傳物質重組,創造和培養植物新品種,對多基因控制農藝性狀的改良和植物基因互作研究具有重要的意義。本文主要綜述了原生質體融合方法、融合機理和融合方式等的研究進展，并且分析了其應用和發展前景。

原生質體；融合方法；融合方式；融合機制；應用

原生質體是指去掉了細胞壁后細胞膜所包圍的裸露細胞。最早期利用機械法制備原生質體，將植物組織放在高滲糖溶液中浸泡一定時間，細胞發生輕微質壁分離，原生質體收縮成球形；然后用機械破碎組織，一些完整原生質體從傷口處釋放出來[1]，但用這種方法得到的原生質體的數量較少，且受植物種類的限制。1960年英國科學家Cocking第一次用酶法大量制備原生質體[2]。這種方法是把材料放入能降解細胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間來降解細胞壁，可以釋放大量有活力的原生質體。目前，人們對原生質體的制備和培養進行了不少研究,而且對原生質體的融合也開展了大量的研究。原生質體融合在品種改良、基因轉化和基因相互作用等生物工程領域得到了廣泛的應用。

1 原生質體融合的目的和意義

兩種異源（種、屬間）原生質體，在外力（誘導劑或促融合劑）作用下，兩個或兩個以上的異源原生質體相互接觸，從而發生膜融合、胞質融合和核融合并形成體細胞雜種。通過細胞培養技術，雜種細胞可進一步發育成雜種植物體。這個雜種后代有可能兼有兩個親代的一些優良性狀。

原生質體融合可以克服遠緣雜交時有性生殖不親和性障礙，擴大了遺傳物質的重組范圍，創造有性雜交方法無法獲得的新型雜種植物。通過原生質體融合可以從一個品種向另外一個品種轉移一些有用的基因，例如，疾病抗性基因、固氮基因、抗凍和抗干旱等基因。原生質體融合技術可以將不同有機體的基因組合到一起創造適合人類需要的新品系，在植物、動物、工業微生物等領域創造新品種研究和基因互作研究中將會發揮重要的作用。

2 原生質體融合方法及其機理

廣義上講，原生質體融合分為自發融合和誘導融合兩種。自發融合是指在分離原生質體期間原生質體經常自發地合并的現象[3]。在酶處理期間，來自鄰近細胞的原生質體通過胞間連絲融合形成多核細胞，這種現象也是自發融合[4]。自發融合現象對于原生質體的分離是不利的。在融合誘導化學試劑的作用下不同來源的原生質體融合稱為誘導融合。正常情況下，分離的原生質體彼此并不融合，因為分離的原生質體表面攜帶負電荷（10mV -30mV）圍繞原生質膜的外部。原生質體的負電荷主要是由于膜內的磷酸基團產生的。因此，由于它們有同樣的電荷，在原生質體之間有一個強大的相互排斥的趨勢。因此，這種類型的融合需要一種融合誘導化學物質或者外力來減少原生質體的負電性，允許原生質體融合[5]。

誘導分離的原生質體融合主要有機械融合法、化學融合法和電融合法三種方法。

2.1 機械融合法

分離的原生質體在顯微操作儀下產生緊密的物理接觸而融合。

2.2 化學融合法

已經用了幾種化學物質來使原生質體融合，如：硝酸鈉、Ca2+、PEG和二甲亞砜（DMSO）等?；瘜W融合劑引起分離的原生質體彼此粘附，導致緊密粘著產生融合[6]?；瘜W融合是一種非特異性、費用低的、能夠產生大量融合產物的融合方法，但是這種方法缺點是可能對細胞有毒、非選擇性和融合效率低。

2.2.1 NaNO3融合法

1970年POWER等第一次描述了用0.25M NaNO3作為融合劑伴隨離心促進玉米與燕麥原生質體融合[7]。1972年，美國研究者卡爾森（Carlson）等采用0.25M NaNO3誘導融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質體，培育出世界第一株體細胞雜種[8]。其方法是首先將分離的原生質體通過漂浮在10%蔗糖等滲溶液中清潔，轉移這原生質體到含有 0.25M NaNO3的10%蔗糖溶液中。其次，在35℃的水浴中溫育混合物。為了提高原生質體的融合效率，先將原生質體蔗糖溶液低速離心來促進融合，接著將沉淀懸浮后溫育在水浴中，這步驟可以重復多次。然后，將含有融合的原生質體融合緩沖液通過用液體培養基稀釋來取代，將原生質體溫育到水浴中，這一步驟可以重復2次以上。最后，將干凈的原生質體涂抹在固體培養基平板上，可以在倒立顯微鏡下觀察細胞融合情況，也可以進行培養。

NaNO3誘導原生質體融合的機理是鈉離子能中和原生質體表面的負電荷(-10～-30mV)，使原生質體不再相互排斥，凝聚原生質體，原生質體質膜靠近而融合[9]。但是這種方法的融合率低0.1%-4%，產生很少的異核體，并且原生質體的吸收能力改變。

2.2.2 高pH-高濃度鈣離子融合法

一般情況下，與鈉離子和鉀離子比較，鈣離子影響細胞融合的效率是很低的[10]，但是在高pH環境中高濃度鈣離子會誘發融合效應。這種方法是凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）1973年為了融合兩種不同的煙草原生質體發明的[11]，現在普遍使用。其方法是將分離的兩個品系的煙草葉肉原生質體，混合在融合誘導緩沖液（0.05M CaCl2，0.4M甘露醇溶液，0.05M甘氨酸-NaOH緩沖液pH 10.5）中，50 g離心30分鐘，在37℃水浴溫育。原生質體馬上聚集，在10min內發生融合，融合率可以達到 10%；水浴中溫育 40-50min后，原生質體融合率可以達到 20-50%。但是這種方法僅僅適合葉肉原生質體的融合。這種方法的機理為，鈣離子中和原生質體膜或細胞膜表明表面電荷，使聚集的原生質體的膜緊密接觸，決定質膜的穩定性和可塑性；高pH能改變質膜的表面電荷，有利于細胞融合。很多種間和種內的體細胞雜種就是使用這種方法產生的。值得注意的是,鈣離子濃度和pH范圍因植物種類不同而異。這種方法的高pH值或許對有些細胞是有毒的。

2.2.3 葡聚糖、聚乙烯醇（PVP）、合成的磷脂也用作細胞融合

1975年，Kanega用不同濃度的甘露醇處理煙草原生質體獲得了20%以上的融合率；1978年，Nagata用15%聚乙烯醇+0.05mol/l氯化鈣+0.3mol/1甘露醇組成的融合劑，成功地將煙草與大豆、煙草與蘿卜等原生質體融合[12]。

2.2.4 PEG融合法

20世紀 70年代初，華裔科學家高國楠發現聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質體融合[13]。PEG是一種大分子（分子量 1000-6000）的水溶性的多聚化合物。一般地使用28-50%PEG溶液用于細胞融合。因為PEG液比病毒更易制備和控制、活性穩定、使用方便、而且促進細胞融合的能力更強，因此，在化學藥品融合劑中，PEG作為細胞融合劑應用最為廣泛，可以誘導高頻率的異核體的形成。

一般使用兩種實驗方法完成原生質體融合。方法一，取大約0.6ml的PEG融合液(20～45%PEG,moL.wt.1500, 0.1M甘露醇、山梨醇或 蔗糖, 8-10 mmol CaCl2,和0.7mMKH2PO4，pH 5.6)以滴的形式添加到試管中的原生質體中。在蓋好試管后，PEG中的原生質體在室溫溫育40min。偶爾旋轉試管使原生質體接觸。在每間隔10 min 后向試管中添加0.5-1ml的原生質體培養基來稀釋PEG。離心除去融合液，將原生質體沉淀懸浮在培養液中。方法二，取兩種原生質體（密度為 1×105個/毫升）混合液（比例為 1:1）0.1-0.5ml，靜置 3～5min。首先加入融合液 A（2-8mM CaCl2，0.5-0.7mM KH2PO4，0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇，25%-30%PEG（wt.6000），pH 5.8）0.1-0.5ml，25℃保持15-20min；然后加入融合液 B（2-8mM CaCl2，0.5-0.7mM KH2PO4，0.1-0.2mM 甘露醇或山梨醇，pH 7.0-10.0）0.1-0.5ml，25℃保持10-20min，完成原生質體的融合；再用培養液洗滌（3～4次），離心（100×g）5min，可以用來觀察和培養，這種 2 步融合法在實驗室中廣泛應用。有學者對PEG 介導的原生質體融合方法進行了改進，由原來的2步融合分為3 步，逐漸降低PEG 的濃度，逐步提高溶液中Ca2+的濃度和pH 值，微量化且省略了離心步驟，操作更簡單[14]。

影響PEG融合法的因素有PEG的種類、純度、濃度、處理時間及原生質體的生理狀況和密度等。其中，PEG的分子量和濃度在誘導成功的融合中是關鍵的。分子量小于100的PEG不會產生緊密的粘連，然而分子量為6000的PEG在誘導融合時是非常有效的。但是，較高分子量的PEG會產生太粘的溶液而不容易被操作。低溫(10)℃比常溫( 25)℃下培養的原生質體融合的速度增加[15]。近年來一些研究建議在PEG溶液中加入融合促進劑(伴刀豆球蛋白、二甲基亞砜、鏈霉蛋白等), 可有效提高原生質體的融合頻率。

PEG誘導原生質體融合的機理是，帶有大量負電荷的PEG與水之間的氫鍵結合，使溶液中自由水消失，由于高度脫水引起原生質體凝集，形成大小程度不同的凝集物，鄰近的原生質體之間緊密接觸；PEG帶有大量的負電荷,能夠結合Ca2+，與原生質體表面的負電荷連接，形成靜電鍵，促使異源的原生質體間的粘著和結合；此外，PEG分子具有輕微的負極性，可以與具有正極性基團的水分子、蛋白質、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質體間起到分子橋的作用，使原生質體接觸。在原生質體細胞膜與膜緊密接觸的部位，膜內蛋白質顆粒易位并凝聚。當PEG被洗脫的時候出現原生質體融合，可能是相鄰的剝去蛋白質的細胞膜間的類脂質與類脂質反應產生擾動和重排，導致接觸的細胞膜局部發生融合，形成很小的細胞質橋，之后它逐漸擴大，兩個原生質體最終融合[16]。

PEG誘導融合的優點是沒有種間、屬間和科間的特異性或者專一性，幾乎可誘導任何原生質體間的融合，融合過程不受物種限制，所以這種方法使用廣泛。PEG法的融合頻率可達10%～15% ,融合實驗成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高。但是也有缺點，融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒性，經驗性大。

2.2.5 PEG結合高pH-高濃度鈣離子融合法

20 世紀70 年代中期,Kao等建立了聚乙二醇( PEG) —高pH高鈣法[16]。直到20世紀90年代,所獲得的體細胞雜種大部分是用這種方法誘導融合產生的，是最有效的融合方法。

這種融合方法的操作步驟是，取原生質體懸浮液約1mL(各0.5mL) ,滴入直徑為6 cm的培養皿中間的18 ×18mm2蓋玻片上或直徑為1.5 cm的玻璃離心管中,靜置5min待形成薄層原生質體后,加入等量的 PEG液(0.1-0.2M 蔗糖, 0.17mM KH2PO4, 10.0 mM CaCl2?2H2O, 20-40% PEG6000 (W /V),10% DMSO (W /V), pH 5.2-5.8),靜置約15-25 min后加入2-3 ml高 Ca2+高 pH 液(300mM 葡萄糖, 50mM CaCl2?2H2O,50mM 甘氨酸- NaOH緩沖液 pH 10.5),處理10-20min,添加洗滌液離心洗滌3次(700 rpm, 5 min),再用培養液洗滌2～3次，最后，將融合體用培養液懸浮,于原皿中進行液體淺層培養或轉入小培養皿中進行固體平板培養(固液比為11)∶[17,18]。有學者對這種方法進行了改進,用Ca(NO3)2代替CaCl2，并省略了離心步驟，微量化操作，在草木樨狀黃芪和木本霸王之間誘導融合得到了科間融合細胞[19]。

其作用機理是，在高Ca2+和高pH溶液的作用下，將高鈣離子與質膜結合的PEG分子洗脫，將進一步加劇電荷平衡失調并重新分配，使兩種原生質體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質膜的融合體，從而提高融合幾率。

雖然多種化學試劑已經被廣泛用于原生質體融合，但是它們存在一些缺點。各種植物原生質體之間融合過程和融合劑濃度可能存在差異，融合效率是可變的，并且各種融合劑對原生質體可能產生毒害作用。所以用物理的電融合法來融合原生質體是一種趨勢。

2.3 電融合法

20世紀80年代齊默曼（Zimmerman）等建立電場誘導細胞融合技術。這是一種更具有可重復性的原生質體融合方法[20],是目前最流行的物理誘導融合方法[21]。

電融合法有2個步驟，(1) 將待融合的原生質體在低導電率融合液中混合，取約100 μl懸浮在兩極之間，將融合小室接好電極后至于倒置顯微鏡下，施加高頻 (0.5-1.5MH2)、場強為30v-300v/cm 的交流電場，處理時間為20s-1min。 在非均勻交流電場（可變電場）中，原生質體的表面電荷發生極化，原生質體偶極化而沿電場線方向泳動, 并相互吸引形成與電場線平行的原生質體鏈；(2) 施加一次或多次瞬間(10-100μS)直流高壓電脈沖(1-3Kv / cm)，脈沖寬度為40-60μs，每次間隔 1s，使質膜可逆性擊穿，互相接觸的質膜瞬間被電擊破后, 又迅速連接閉合, 恢復成嵌合質膜形成融合體[22]。靜置融合小室 20-30min，在倒置顯微鏡下觀察融合過程。在原生質體開始融合時, 應短時重復施加交流電場以保持原生質體間的緊密結合狀態, 然后使電場強度慢慢降至零。

電融合法的分子機制為，通過交流電脈沖，原生質體成鏈，兩細胞膜緊密接觸，且膜表面的蛋白質分子分離，產生了無蛋白的類脂區。在直流電脈沖的誘導下，原生質體質膜表面的電荷和氧化還原電位發生改變，膜結構局部擾亂，形成小孔。而相對的脂雙層間分子在范德華力作用下，形成脂分子橋。由于連接處的細胞膜表面曲率大，處于高張力狀態，最終導致兩細胞逐漸融合成一個大的球狀細胞。影響電融合的效果主要是電壓大小、持續的時間和原生質體的尺寸[23,24]。

與PEG法比較，電融合法有許多優點。誘導僅發生在質膜接觸部位，對細胞毒害作用小，大大提高了融合頻率(60%～80 %)[25]，在燕麥和煙草等原生質體產生融合率可達60% 以上20；融合參數容易控制，操作簡便,可在顯微鏡下觀察融合的全過程，重復性強；融合過程在幾分鐘內完成，同步性好，活細胞數目多；電融合在保持原生質體的活力,減少細胞膜的損害和原生質體的畸變和破裂等方面都要好于化學融合。但是電融合法需要昂貴的電融合儀, 因此目前仍不如化學法適用普遍[26]。

總之，不管是化學融合法還是電融合法，原生質體之間的融合是由于相互接觸的原生質體的膜脂相互作用產生膜脂重排、融合，最后形成了融合的細胞。在化學融合法加入Ca2+可以引起質膜上的界面動電位還原，中和了膜上的負電荷，導致膜內接觸，誘導膜融合[27]。另外一些解釋認為，當原生質體緊密粘連時，外源的融合劑引起分布在細胞膜內的蛋白和糖蛋白上。這樣增加了膜的流動性并且產生了油脂分子混入的區域，容許相鄰膜的合并。大分子聚合物 PEG（1000-6000）作為一個連接原生質體之間的分子橋起作用，并且增加了流動性。當兩個原生質體分子距離等于或者小于10 ? 時，原生質體發生融合，表明原生質體融合是一個高度創傷性的事件[22]。

在促融合劑作用下原生質體的融合過程是，原生質體先出現凝集現象，然后部分凝集細胞之間的膜產生粘連，發生膜融合形成多核細胞。在培養過程中多核細胞又進行核的融合而成為單核的雜種細胞，而那些不能形成單核的融合細胞在培養過程中逐漸死亡。

3 原生質體融合的方式

原生質體的融合方式常見的有對稱融合和非對稱融合兩種。通過這兩種融合方式可產生對稱雜種、非對稱雜種和胞質雜種3種類型。另外還有一類雜種叫異質雜種。同時, 還有配子-體細胞融合和亞原生質體- 原生質體融合[28]。

兩個完整的原生質體之間的融合是對稱融合，它結合了兩個參與者的完整基因組。通過原生質體對稱融合，已經成功地從野生性轉移了一些重要抗性到融合植株中[29,30]。原生質體的對稱融合中，除了有重要農藝性狀的基因以外，有害的基因也轉移到了融合植株體內。此外，對稱融合得到的多倍體雜種, 實現了不同種間、屬間甚至族間的遺傳重組, 但倍性升高后導致一些經濟性狀的下降, 因而原生質體融合得到倍性不增加的二倍體胞質雜種是植物細胞工程領域的研究方向之一[31]。為達到這個目的，19 世紀80年代以后,采用非對稱融合方式, 既可以克服育種障礙又不增加雜種倍性。

利用物理或化學方法使一個親本的核失活，再與另外一個完整的細胞進行融合方式稱為不對稱融合。一般用射線(X射線或γ射線) 、紫外線等照射的核失活原生質體作為供體，射線照射打斷了完整的染色體結構，導致核失活，細胞不能分裂；用代謝抑制劑如碘乙酸( IA) 、碘乙酰胺( IOA) 、羅丹明- 6G( R- 6G) 等處理的原生質體作為受體，抑制細胞的能量代謝，使細胞質失活，細胞不能生長；當供體和受體融合形成融合體發生互補后才能生長，從而篩選出雜種。該法有可能免除雜種細胞的篩選過程[32]。例如：用紫外線（UV）照射過的花煙草葉肉原生質體與 0.25mM 碘乙酸鈍化后的烤煙品種K326葉肉原生質體，經PEG法融合、再生植株，獲得的再生植株可能有受體親本全套核基因和供體親本的部分染色體[33]。用軟 X 射線(0.1167 Gy/s)照射過的疣粒野生稻原生質體作供體, 2.5 mmol/L碘乙酰胺(IOA)處理15min后水稻栽培品種 02428 的原生質體經作受體，進行不對稱融合，經過PEG法得到栽體細胞雜種，表明疣粒野生稻對水稻白葉枯病的抗性成功地轉移到栽培稻中[34]。

不對稱融合有意識地去除（或殺死）某一親本的細胞核，與另一親本的胞質或者完整原生質體雜交，得到一個親本細胞核與另一親本的胞質或者兩個親本細胞質的體細胞雜種稱為胞質雜種。胞質雜種可以通過三種途徑產生：一個正常的原生質體和一個去核的原生質體融合；一個正常的原生質體和一個核失活的原生質體融合；細胞對稱融合以后某一階段一個親本的核或染色體被排除[31]，但是這種情況具有一定的偶然性。胞質雜交可用來轉移細胞質基因所決定的遺傳性狀，如胞質雄性不育特征，對某些抗生素的抗性，以及一些與光合作用有關的特性等。不對稱融合只有DNA重組而沒有額外的染色體的作用,避免了胞質基因供方的野生性狀進入雜種，其遺傳性狀穩定,有希望成為直接用于育種的一種有效途徑[35]。

4 展望

植物原生質體融合技術以植物的原生質體為材料，通過物理、化學等因素的誘導，使兩個原生質體融合成雜種細胞，雜種細胞再生成植株，為植物育種和基因互作研究提供了條件。誘導原生質體融合的方法化學融合法和物理的電融合法。目前廣泛使用PEG法和電融合法，并發展出微融合法。電融合法與微培養法相結合，建立了單對原生質體融合技術程序,解決了融合細胞的選擇問題，是一種有前途的技術。目前正在研究用電腦控制進行自動化操作，以提高操作效率。在融合煙草原生質體時使用激光融合法避免了親本原生質體中葉綠體分布的影響[36]，是近年來比較新的一種方法，但是目前聚集微素激光法應用很少。

利用細胞的全能性，融合細胞可以被誘導再生成植株，可以培育異核體雜種。作物的優良性狀往往受多基因控制，基因工程很難實現多基因轉移，而原生質體融合為一次性多基因性狀的改良提供了途徑,并且為生物遠緣雜交提供了一條途徑。對稱融合在導入有用基因的同時，也帶入了新的全部不利基因，所以采用不對稱融合來轉移特定的性狀是一個研究方向。遺傳物質有少量遺傳基因存在于細胞質內，如雄性不育基因、抗除草劑基因就存在于細胞質的葉綠體及線粒體上。利用原生質體不對稱融合已成功育出了具有雄性不育特性的油菜、水稻細胞質雜種。隨著不同植物胞質體分離技術的成熟， 胞質體-原生質體融合形成胞質雜種將會在胞質基因組改良方面發揮作用。

目前，通過體細胞雜交技術研究，不僅創造了許多融合方法和融合方式，而且對雜種細胞的篩選以及雜種植株的鑒定和培養進行了大量的工作，取得了很大進展，但是也存在一定的不足。原生質體雜交需要篩選雜種細胞，雜種細胞再生能力差，雜種植株性狀較差(不育、生根能力差、生長勢較弱等)是原生質體融合技術中的主要問題。因此，需要研究誘導融合及雜種細胞的各種生理生化和遺傳機理。開展各種植物的原生質體再生技術研究。探索外源遺傳物質導入原生質體的條件及研究其在原生質體中的表達機制。研究雜種細胞培養和雜種植株的鑒定。將原生質體融合與遺傳轉化、常規雜交等育種方法結合起來, 更有效地轉移優良性狀, 創造優異種質，使這一技術成為研究植物改良和基因相互作用的一種有效的手段。

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Q2-3

A

1673-2219（2011）12-0030-05

2011－03－20

黃國文（1965－），湖南郴州人，博士，從事細胞工程技術教學和科研工作。

(責任編校:何俊華)