胎盤Hofbauer細胞介導的HBV與HBIG阻斷的相關性

孫麗娟 孫 淑媛 朱 寶申 尹華春

我國是乙型肝炎(HBV)高發區，隨著乙肝疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白的應用，乙型肝炎的母嬰傳播已明顯減少，但HBV宮腔內感染仍是乙型肝炎母嬰阻斷工作中的難題，孕婦血清中HBV病毒達到一定量時可使胎盤組織受染，繼而引起宮腔內感染。胎盤Hofbauer細胞是存在于胎盤中的免疫細胞，具有游走和抗原提呈的特性，可對外來抗原(細菌和病毒等)進行吞噬、加工和提呈［1］。目前文獻報道垂直傳播組胎盤Hofbauer細胞總數及結合HBV的Hofbauer細胞數明顯高于非垂直傳播組。而在未感染HBV母親的胎盤中，Hofbauer細胞非常少，提示Hofbauer細胞在HBV經胎盤母嬰垂直傳播中具有重要作用。孕期是否注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)進行阻斷一直以來是個存在爭議的話題，我們經過長期的臨床觀察及對比研究，發現孕期注射乙肝免疫球蛋白可中和部分乙肝病毒，但對母嬰阻斷不能起到決定性作用，甚至會導致乙肝病毒變異從而增加宮內感染的幾率。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選 擇2008至2010年在河北省石家莊市第五人民醫院分娩的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽性孕婦及其所生新生兒100例為研究對象，其中50例孕婦于孕28、32、36、39周分別肌內注射乙肝免疫球蛋白(成都蓉生制藥生產)200/400 U，(HBsAg、HBeAg雙陽性孕婦和/或 H BV-DNA ＞500 U/ml每次注射400 U，HBsAg陽性且HBV-DNA＜500 U/ml孕婦每次注射200 U)，行產前母嬰阻斷。50例產前未給予任何治療。另外選擇同期該院住院分娩的HBsAg陰性，且HBVDNA＜500 U/ml孕婦20例作為對照。孕婦平均年齡27歲;孕周37～42周，新生兒平均體重(3 250±859)g，其中男嬰56例，女嬰64例，無畸形兒。排除慢性乙型肝炎肝功能中度以上異常，妊娠期高血壓綜合征，孕期或產前6個月給予抗病毒藥物等干擾因素，經實驗室檢查包括垂直傳播組［母嬰血HBsAg和(或)HBV-DNA均為陽性］;非垂直傳播組［母親血HBsAg和(或)HBV-DNA均為陽性;新生兒外周血HBsAg和HBV-DNA均為陰性］。均排除皰疹病毒、梅毒、丙型肝炎、弓形體、艾滋病(HIV)及其他病毒感染。

1.2 方法 血 清檢測:采集孕婦肘靜脈血3 ml，胎兒娩出6 h內股靜脈血2 ml，1 500轉/min離心分離血清，20℃保存備用。新生兒采血后6 h內常規注射HBIG和乙肝疫苗。測定采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA，廈門英科新創科技公司)測定孕婦及新生兒外周血清 HBsAg，采用PCR技術測定孕婦及新生兒外周血清HBV-DNA(中山醫科大學達安基因股份有限公司)結果檢測全在自動酶聯檢測儀 (MultiskanMK 3)上進行。檢測步驟:胎盤娩出后5 min內，取胎盤組織中央、邊緣、中央與邊緣1/2處各1 cm3，用10%戊二醛進行固定，然后沖洗、脫水、滲透包埋、切片制作。免疫組織化學細胞周圍棕黃色為陽性染色，每張切片選擇5～6個高倍視野，計數不少于500個細胞，取均數并評分:不著色為0分，著色淡為1分，著色深為2分;著色細胞占計數細胞百分率:≤5%為0分，6% ～20%為1分，21%～49%為2分，≥50%為3分，染色程度與染色細胞百分率得分乘積為最后得分。宮內感染陽性標準:新生兒出生6 h內未接受主被動聯合免疫前靜脈血 HBsAg和/或HBV-DNA陽性。0～1分為陰性病例，2分以上為陽性病例。

1.3 統計學分析 應用 SAS 10.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎兒宮內感染 檢出率為8.0%(8/100)，其中垂直傳播(母親及新生兒HBsAg均為陽性)8例，其中新生兒HBV-DNA陽性2例。8例宮內感染新生兒中產前注射乙肝免疫球蛋白及未注射乙肝免疫球蛋白的各4例，2例HBV-DNA陽性新生兒為產前阻斷新生兒。非垂直傳播 (母親HBsAg陽性，新生兒HBsAg陰性)92例。對照組無1例檢出。

2.2 胎盤HBsAg的免疫組織化學 胎盤組織中的 HBsAg呈現棕黃色信號，垂直傳播8例全部胎盤均檢測出棕黃色信號，陽性率為100.0%;非垂直傳播92例胎盤檢測出 HBsAg陽性41例，陽性率為44.6%，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.3 HE染色 光學顯微鏡下垂直傳播組和非垂直傳播組孕婦的胎盤病理學改變基本相同，均有大量淋巴細胞、多形核白細胞、顆粒細胞浸潤，及組織壞死水腫;絨毛及絨毛間質的病理改變中有絨毛水腫，干絨毛動脈硬化，絨毛間質纖維化和纖維素樣沉積。對照組孕婦的胎盤間質較致密，結構完整，絨毛分支細而密，極少有水腫和壞死。于垂直傳播組的胎盤Hofbauer細胞中可見圓形或卵圓形成熟病毒顆粒，形狀不規則，大而飽滿，由雙層膜樣結構包繞密度較高的同心圓顆粒樣核心抗原組成。而在非垂直傳播組，Hofbauer細胞中偶可見到病毒顆粒，但極少見到大而飽滿的成熟病毒顆粒。

3 討論

HBV宮內感染的母嬰阻斷一直以來是母嬰阻斷工作中的難題，是導致母嬰垂直傳播的主要途徑。本研究通過比較對照組、垂直傳播組和非垂直傳播組胎盤組織結構、胎盤HBV感染及其與 Hofbauer細胞的關系，發現垂直傳播組受到 HBV感染的胎盤結構被破壞。HBV主要感染胎盤滋養細胞、Hofbauer細胞和血管內皮細胞。已有資料表明，某些病原體如人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV 1)感染胎盤后，可在一定程度上激發細胞免疫反應，滋養層細胞可釋放趨化因子，誘導胎盤血管中的免疫細胞游離出血管進入胎盤組織，參與炎性反應［2，3］。單核細胞是許多病毒隱匿和復制的場所。Hofbauer細胞也屬于單核細胞系統，因而也可能成為HBV在胎盤中隱匿和復制的場所［4］。研究發現，病毒感染胎盤后多聚集在絨毛間質的 Hofbauer細胞內或其周圍;Hofbauer細胞獲取病毒后不能完全殺死病毒，反而成為了病毒寄生、復制的場所，并進一步成為傳播的媒介［5］。研究發現HBV感染孕婦76%的胎盤受到 HBV感染，病毒多聚集在絨毛間質的 Hofbauer細胞內或其周圍，提示Hofbauer細胞能富集胎盤靠近母體面的病毒［6－8］。正常情況下Hofbauer細胞可捕獲并殺滅HBV病毒，但HBV病毒感染可使Hofbauer細胞殺滅病毒能力減弱，反而成為病毒傳播的載體，及復制場所，導致宮內感染。本研究在 Hofbauer細胞周圍及其細胞內找到了各種病毒樣顆粒(管狀病毒包涵體、空心病毒抗原顆粒或成熟的病毒顆粒)，提示Hofbauer細胞在可能是導致HBV母嬰垂直傳播的罪魁禍首。空心的病毒抗原顆粒為尚未組裝的抗原，而管狀病毒樣顆粒為病毒芽生的特殊時期，成熟的病毒顆粒(Dane)具有高度傳染性，這些反映病毒可在Hofbauer細胞內增生復制。本次研究發現8例宮內感染新生兒中產前注射HBIG及未注射乙肝免疫球蛋白的各4例，2例HBV-DNA陽性新生兒為產前阻斷新生兒。由此可推測孕期注射HBIG后，可能會導致部分個體HBV病毒體在一定程度S區變異，變異的HBV感染胎盤后，感染其中的免疫細胞(Hofbauer細胞)，使免疫功能受損，甚至宿主免疫耐受，病毒不宜被識別，從而不能被完全殺死，胎盤的Hofbauer細胞可游走于胎盤母體與胎兒之間，而大量的Hofbauer細胞位于絨毛毛細血管周圍，并隨著細胞進入胎兒血液循環致使胎兒宮內感染。胎兒和新生兒免疫細胞尚未發育成熟，當其受HBV抗原物質，尤其是小分子量HBeAg直接刺激和誘導時，Th細胞可發生免疫耐受，導致被感染胎兒或新生兒的CTL殺傷力降低，B細胞分泌特異性抗體減少，不能產生足夠的免疫應答，導致免疫耐受［9］，雖然HBIG和基因重組乙肝疫苗的免疫效果得到了充分肯定，但由于HBV變異及宿主免疫耐受等因素，接種乙肝疫苗仍可能失敗［10］，從而導致母嬰垂直傳播的阻斷失敗。本研究首次對孕期注射HBIG后感染HBV病毒的 Hofbauer細胞進行了超微結構變化觀察，發現在 HBV垂直感染組中，胎盤 HBV感染可使Hofbauer細胞胞漿內線粒體腫脹，胞漿突起減少，胞漿內線粒體峭減少，粗面內質網及高爾基體萎縮，說明細胞轉運水、電解質及吞噬功能減弱;胞漿內溶酶體減少，溶解和消化病原體的能力減弱，這將削弱胎兒在宮內受到免疫保護的能力。HBIG能中和體內表面抗原，并將病毒清除，但是此種蛋白不能進入肝臟，特別是肝細胞內，因此，HBIG必須在乙型肝炎病毒進入肝細胞前應用才能有效。故認為孕期注射乙型肝炎免疫球蛋白能減少體內病毒數量的說法并不可靠。但HBIG有被動免疫功能，孕期注射HBIG，抗HBs可通過胎盤到達胎兒體內，使胎兒在宮內獲得被動保護而減少HBV感染幾率［11］。但當孕婦體內乙肝病毒HBVDNA濃度達到108U/ml以上時，即使孕婦從28周后多次注射HBIG等，仍有43%的嬰兒發生宮內傳播。有研究分析比較了全程接種后的嬰兒和母體內相關的基因序列，發現有堿基突變現象，而且比較普遍，主要是在免疫的壓力下產生的。這個基因突變使疫苗的免疫功能下降，從而使機體的抗體水平下降，導致了宮內傳播阻斷失敗［12］。這次研究中2例HBV-DNA陽性新生兒的母親血液HBV-DNA均在107～108U/ml，故考慮胎兒宮內感染的原因可能與HBV病毒變異有關。

綜上所述，對于HBV-DNA定量較高的孕婦不建議孕期注射乙型肝炎免疫球蛋白，防止人為干預誘導病毒發生基因突變，導致宮內感染。應采取其他阻斷方案，例如孕晚期服用抗病毒藥物等，通過減少體內病毒數量，從而減少宮內感染機率，增加母嬰阻斷成功率。

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