擬南芥COI1基因在茉莉素信號傳導中的作用

陳 艷，任春梅,2

(1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；

2.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

茉莉素（jasmonates，JAs）是一類發現較晚的植物激素，它包括茉莉酸（jasmonic acid，JA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）以及由茉莉酸衍生的其他一系列具有相似生物活性的化合物。茉莉素能調節許多植物生長發育過程，包括根生長、雄蕊發育、塊莖形成、衰老和果實成熟等，介導植物對生物和非生物脅迫的抗逆反應，如：機械傷害、昆蟲侵害、病原菌侵染和紫外線損傷等。因此，茉莉素對植物的生存至關重要。在擬南芥中，如果茉莉素的生物合成或者信號傳導受阻，植株會因雄性不育而無法完成生命周期。同時，植株也會因失去對逆境(如昆蟲侵害、病原菌侵染等)的抗性而無法生存。在茉莉素信號傳導中，COI1基因起著非常重要的作用。缺失該基因的擬南芥植株喪失了所有的茉莉素反應，表現為雄性不育、易感染病蟲害等。

1 COI1基因突變對茉莉素信號傳導的影響

1994年Feys[1]等篩選獲得了對植物毒素冠菌素（COR，COR）不敏感的擬南芥突變體coi1（COR-insensitive1）。冠菌素是假單胞菌分泌的一種致病毒素，與茉莉素具有相似的化學結構和生物活性。他們發現篩選出的所有coi1突變體都對茉莉酸甲酯不敏感，并且表現為雄性不育。隨后的研究發現coi1突變體易感病蟲害，而且失去了對茉莉素的正常反應，如茉莉素誘導的基因表達，茉莉素誘導的花青素積累和側根形成等。

1998年Xie等[2]采用圖位克隆法分離出擬南芥COI1基因。該基因編碼一個含有592個氨基酸的F-box蛋白。在coi1-1突變體中，編碼COI1蛋白第467個氨基酸色氨酸的密碼子突變成了終止密碼子，從而形成沒有功能的COI1蛋白片斷。因此，coi1-1突變體完全失去茉莉素介導的生物功能，表現為完全雄性不育、易感病蟲害、不表達茉莉素誘導基因等。而在COI1弱突變體coi1-2中，COI1蛋白的第245個氨基酸由亮氨酸變成了苯丙氨酸，表現為部分地喪失了COI1的功能。與野生型植株相比，coi1-2突變體雖然對茉莉素的反應以及對病蟲害等逆境的敏感性都極顯著地降低，但對茉莉素仍有輕微的反應，表現為部分不育、能產生少量的種子等。由此可見，COI1功能完全喪失會完全中斷茉莉素信號傳導，而COI1部分功能喪失也會影響茉莉素的信號傳導。因此，在茉莉素信號傳導途徑中，COI1起著至關重要的作用，是必不可少的控制因子。

2 SCFCOI1復合體介導茉莉素信號傳導

1998年Xie等[2]通過對分離的COI1基因所編碼的氨基酸序列進行分析，發現COI1是一種F-box蛋白。在酵母和哺乳動物中，F-box蛋白能與Skp1和Cullin蛋白結合組裝成SCF泛素蛋白連接酶復合體（Skp1-Cullin-F-box protein complex）。該復合體可以識別并泛素化某些底物蛋白，進而使這些底物蛋白通過26S蛋白酶體降解。因此，COI1的克隆首次暗示著泛素介導的蛋白降解途徑參與茉莉素的信號傳導。隨后的研究證明了COI1作為F-box蛋白，能與擬南芥Cullin1蛋白和類似于Skp1的擬南芥ASK1或ASK2組裝成SCFCOI1復合體，介導茉莉素的信號傳導[3－5]。COI1完全突變體coi1-1喪失了茉莉素調控的所有反應，正是由于突變的COI1蛋白不能形成SCFCOI1復合體所導致。位于COI1蛋白F-box結構域的第22位氨基酸由谷氨酸突變為丙氨酸，也會破壞SCFCOI1復合體的形成，從而喪失了對茉莉素的反應[3]。與擬南芥COI1同源的大豆F-box蛋白GmCOI1也能與擬南芥的ASK1和Cullin1形成SCFCOI1復合體，介導茉莉素的信號傳導[6]，說明F-box蛋白COI1是植物茉莉素信號傳導中保守的成分。

3 JAZ蛋白是SCFCOI1復合體的一類底物蛋白

2007年，Thines和Chini等[7-8]分別發現含有12個成員的JAZ蛋白家族是茉莉素信號途徑中的一類抑制蛋白。JAZ蛋白是SCFCOI1泛素連接酶復合體的一類直接底物。茉莉素信號分子可以誘導SCFCOI1復合體結合JAZ蛋白，使其泛素化并通過26S蛋白酶體降解，最終解除JAZ蛋白對茉莉素信號通路的抑制作用，引起下游茉莉素反應。

JAZ蛋白含有中央的27個氨基酸組成的ZIM結構域和C末端Jas結構域。ZIM結構域同時也介導JAZ蛋白與其共抑制因子NINJA的相互作用，從而共同抑制茉莉素信號通路[9]。Jas結構域介導JAZ蛋白對茉莉素信號通路正調控轉錄因子MYC2的直接抑制作用[7,10]。

JAZ家族成員眾多，且有不同的轉錄本。例如JAZ10.4是JAZ10基因的一個轉錄本。JAZ10.4在活性茉莉素分子存在的情況下不能與COI1相互作用，但仍可抑制轉錄因子MYC2。JAZ10.4可以通過ZIM結構域與自己或其他JAZ蛋白形成同源或異源二聚體的形式拮抗茉莉素反應[11]。這種特殊轉錄本的存在很可能會抑制過度的茉莉素反應。其他JAZ家族成員也普遍存在相似的機制[12]，這使得茉莉素信號途徑更為豐富。

4 COI1是茉莉素信號傳導的受體

在JAZ蛋白被報道之后，很多實驗結果都顯示SCFCOI1-JAZ復合體是接收茉莉素信號并啟動下游信號傳導過程的感受復合體[13-14]。但至此還不清楚SCFCOI1-JAZ復合體中哪一個蛋白是茉莉素的受體。2009年4月，Roberto Solano實驗室發現螯合異亮氨酸（Ile）的茉莉酸分子（+）-7-iso-JA-Ile是植物體內茉莉素的活性形式[15]，這為茉莉素受體的發現提供有利條件。

2009年，清華大學生命科學學院謝道昕教授實驗室通過遺傳學和分子生化的方法，證明了COI1是茉莉素的受體[16]。首先，通過與生長素受體TIR1的同源分析，建立了一個COI1的分子模型，并對其進行優化，得到一個高質量的結構模型，從而分析其作為受體的可行性。該實驗室結合COI1的高質量分子結構模型，進一步通過一系列的生化和遺傳實驗證明了COI1與JA-Ile以及冠菌素的直接作用，最后得到了一個COI1為受體的茉莉素信號感應模型，即：JA-Ile與COI1結合模型。

5 COI1-JAZ共受體模型

2010年10月，Sheard等[17]研究發現，茉莉素的感受機制是受肌醇磷酸增強的COI1-JAZ共受體形式。COI1的晶體結構：總體構架類似于TIR1，有一個N端的三螺旋 F-box模體（接近ASK1），C端由18個串聯的LRRs形成了馬蹄形腔結構域。與TIR1類似，COI1 LRR結構域的上表面有三個內部重復的長環——loop-2,loop-12 and loop-14，這在激素與多肽底物的結合中起作用。與TIR1不同的是，在COI1 LRR結構域折疊的C端頂部序列存在第四個長環loop-c，它在loop-2的上方，部分地覆蓋loop-2。盡管擁有相似的骨架結構，COI1形成了一個與TIR1完全不同的激素結合區域。以loop-2和LRR腔內表面之間結構為基礎，COI1的配體結合口袋特有地被氨基酸側鏈環繞。形成這一口袋的許多殘基為大氨基酸且帶有極性的頭部。這一特性使得他們在近結合配體的某一化學組分時，可以使結合口袋形成一個特定的結構。這一近作用在酵母雙雜交實驗中，對正確的激素感知復合體是極其重要的，COI1蛋白這些側鏈上的大氨基酸某一位點的突變足以打斷COR存在條件下COI1-JAZ1的結合。在結合口袋，JA-Ile和COR均處于“向上”的位置，它們共有的環戊酮的酮基向上，與COI1口袋入口的Arg 496和Tyr 444形成了三角的氫鍵網絡。在沒有JAZ降解子肽鏈的結合，這一酮基部分是可以被溶解的。JA-Ile和COR環戊酮環的剩余部分夾在COI1上的芳香族成員Phe 89和Tyr 444之間，以疏水作用穩定。

COR上的環己烯環提供了一個平整的表面緊密地和Phe89聯系，同時JA-Ile更具彈性和伸展的苯環側鏈與loop2上的Ala 86,Phe 89和Leu 91和LRRs上的 Leu 469和Trp 519結合，這一聯系更為松弛。這一不同或許可以解釋結合實驗中COR比（3R,7S）-JA-Ile幾乎高出十倍。

激素結合口袋的深處，JA-Ile和COR的酰胺和羧基組分通過與COI1的三個氨基酸殘基Arg 85,Arg 348和Arg 409，形成一個鹽橋和氫鍵網絡，結合在結合位點的底部。同時，那些精氨酸殘基構成了激素口袋的帶電平臺。Tyr 386則通過與激素的氨基組分形成氫鍵從頂部加強作用。這樣，Tyr386到達了配體的環戊酮環，縮小了口袋入口并使下方形成了一個疏水的腔?；康氖Ｓ嗖糠謩t由Val 411,Ala 384和Arg 409的脂肪側鏈形成。而COR和JA-Ile的亮氨酸側鏈得的乙基環丙烷組分的大小和疏水性使其二者很少地適合這一空間。這一腔的性質可以解釋COI1對JA衍生物的選擇性，即必須包含一個中度大小的疏水氨基酸。雖然這一配體的大部分結構包裹在結合區域內部，頂部的酮基和底部的羧基部分仍然暴露在外，這使得其可與共受體中的JAZ部分作用。

COI1的開放口袋高特異地識別活性激素形式（3R，7S）-JA-Ile，高親和的激素結合需要一個雙向的JAZ降解序列，在之前的研究中，JAZ蛋白與COI1蛋白的結合區域是位于C端的Jas模體，包含SLX2FX2KRX2RX5PY共同序列并在之前有兩個連續的基本殘基。為進一步定位Jas模體中與COI1高親和配體結合這一微小區域，運用合成的JAZ1多肽片段進行配體結合實驗，最終將由Glu 200-Val 220這一段短序列定義為JAZ1降解子（JAZ1 degron）。這一序列包括一個保守的α-螺旋以錨定在COI1上，還有一個環狀區域以攔截激素使進入COI1的結合口袋。

此外，肌醇-5-磷酸作為第三種重要組分被發現，它與COI1和JAZ均互作，并接近激素所處位置。這一發現，高度體現了COI1蛋白作為F-box蛋白，起多分子信號中心的作用。

6 小 結

茉莉素受體COI1的分離和證明使人們對茉莉素感知及下游信號通路起始的分子機制有了更直接、深刻的認識。而同時，COI1與JAZ蛋白作為共受體形式共同感受茉莉素，這對于F-box蛋白的研究有了進一步的功能認識，豐富了植物激素與受體之間作用模式及激素信號傳導的方式，具有重要意義。

[1] Feys B,Benedetti C E,Penfold C N,et al.Arabidopsis Mutants Selected for Resistance to the Phytotoxin CORAre Male Sterile,Insensitive to Methyl Jasmonate,and Resistant to a Bacterial Pathogen[J].Plant Cell,1994,（5）:751-759.

[2]Xie D X,Feys B F,James S,et al.COI1:an Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility[J].Science,1998,280:1091-1094.

[3]Xu LH,Liu FQ,Lechner E,et al.The SCFCOl1 ubiquitin-ligase complexes are required for jasmonate response in Arabidopsis[J].Plant Cell,2002,14:1919-1935.

[4]Liu F,NiW,Griffith M E,et al.The ASK1 and ASK2 genes are essential for Arabidopsis early development[J].Plant Cell,2004,16:5-20.

[5] Ren C,Pan J,Peng W,et al.Point mutations in Arabidopsis Cullin1 reveal its essential role in jasmonate response[J].Plant J,2005,42:514-524.

[6] Wang Z,Dai L,Jiang Z,et al.GmCOI1,a soybean F-box protein gene,shows ability tomediate jasmonate-regulated plant defense and fertility in Arabidopsis[J].Mol Plant Microbe Interact.,2005,（12）:1285-1295.

[7] Thines B,Katsir L,Melltto M,et al.JAZ repressor proteins are targets of the SCF（COI1）complex during jasmonate signalling[J].Nature,2007,448（7154）:661-665.

[8] Chini A,Fonseca S,Fernandez G，et al.The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling[J].Nature,2007，448（7154）:666-671.

[9] Pauwels L,Barbero G F,Geerinck J,et al.NINJA connects the co-repressor TOPLESS to jasmonate signalling[J].Nature,2010,464（7289）:788-791.

[10]Melotto M,Mecey C,Niu Y,et al.A critical role of two positively charged amino acids in the Jasmotif of Arabidopsis JAZ proteins in mediating COR-and jasmonoyl isoleucine-dependent interactionswith the COI1 F-box protein[J].Plant J,2008,55:979-988.

[11]Chung H S,Howe G A.A critical role for the TIFY motif in repression of jasmonate signaling by a stabilized splice variant of the JASMONATE ZIM-domain protein JAZ10 in Arabidopsis[J].Plant Cell,2009,（1）:131-145.

[12]Chung H S,Cooke T F,Patel L C，et al.Alternative splicing expands the repertoire of dominant JAZ repressors of jasmonate signaling[J].Plant J,2010,（5）:29.

[13]Katsir L,Schilmiller A L,Staswick P E,et al.COI1 is a critical component of a receptor for jasmonate and the bacterial virulence factor COR[J].Proc Natl Acad Sci USA.,2008,105（19）:7100-7105.

[14]Chini A,Fonseca S,Fernandez G，et al.The ZIM domain mediates homo-and heteromeric interactions between Arabidopsis JAZ proteins[J].Plant J,2009,59（1）:77-87.

[15]Fonseca S,Chini A,Hamberg M,et al.（+）-7-iso-Jasmonoyl-L-isoleucine is the endogenous bioactive jasmonate[J].Nat Chem Biol,2009,（5）:344-350.

[16]Yan J,Zhang C,Gu M,et al.The Arabidopsis CORINSENSITIVE1 protein is a jasmonate receptor[J].Plant Cell,2009,（8）:2220-2236.

[17]Sheard L B,Tan X,Mao H,et al.Jasmonate perception by inositol-phosphate-potentiated COI1–JAZ co-receptor[J].Nature,2010,468（7322）:400-405.