蜂膠活性成分及質(zhì)量控制的研究進(jìn)展

北京市保健品化妝品技術(shù)審評中心（100055） 李強(qiáng) 劉東紅

蜂膠（propolis）是蜜蜂從植物芽孢或樹干破皮傷處采集來的樹脂（樹膠），并混入蜜蜂上顎腺的分泌物，與蜂蠟、少量花粉等加工而成的一種具有芳香氣味和黏性的膠狀固體物質(zhì)[1]。蜂膠是蜜蜂用于維持整個群體健康的有效物質(zhì)，一個5～6萬只的蜂群一年只能生產(chǎn)蜂膠100～150g，被譽(yù)為“紫色黃金”。蜂膠因其化學(xué)成分復(fù)雜且生物學(xué)活性廣泛而成為國內(nèi)外研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。

天然蜂膠的基本成份： 樹脂50%～55%，蜂蠟30%～40%，花粉5%～10%。主要活性成分有黃酮類化合物（槲皮素、蘆丁、山奈黃素、白楊黃素、芹菜素、高良姜素、松屬素等）、萜烯類、有機(jī)酸（阿魏酸、咖啡酸、苯甲酸等）、脂肪酸（10-羥基-α-癸烯酸等）、氨基酸、胰蛋白酶等活性酶類、維生素、多糖、30多種微量元素和礦物質(zhì)等共200余種有效成分[2][3]。

蜂膠具有抗感染、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗輻射；降血脂、降血糖、降血壓、降膽固醇；增強(qiáng)免疫、清除自由基、美容、促進(jìn)組織再生等作用[4][6]。蜂膠在臨床內(nèi)科、外科、皮膚科、耳鼻喉科、婦科、內(nèi)分泌及代謝性疾病等均有應(yīng)用[5][6]。

蜂膠制品有兩類，一類是以水為載體的，即所謂水溶性蜂膠；另一類是以酒精為載體的，即所謂醇溶或酒精溶的蜂膠。原膠（即從蜂箱中直接取出的蜂膠）中含有雜質(zhì)，而且重金屬含量較高，不能直接食用，必須經(jīng)過提純、去雜、去除重金屬如鉛等之后，才可用于加工生產(chǎn)各種蜂膠制品。蜂膠的活性成分因產(chǎn)地、氣候、儲存方式、提取工藝的不同而不同，從而使蜂膠質(zhì)量和功效存在差異。

蜂膠的質(zhì)量控制貫穿于收購和加工的全過程，隨著現(xiàn)代各種檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是近年來色譜技術(shù)的日益發(fā)展、檢測手段和能力的不斷增強(qiáng)，為蜂膠中有效成分含量測定的研究提供了良好的工作平臺。采用先進(jìn)的現(xiàn)代分析技術(shù)色譜、光譜、電泳技術(shù)以及聯(lián)用技術(shù)，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過現(xiàn)代儀器分析方法，分析蜂膠中的有效成分和特有的芳香物質(zhì)，建立起相應(yīng)的科學(xué)的質(zhì)量技術(shù)評價(jià)平臺和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)平臺，最終推廣到行業(yè)應(yīng)用，從而確保蜂膠質(zhì)量穩(wěn)定可控，使蜂膠這一寶貴的資源能更好地造福于人類。現(xiàn)對蜂膠活性成分及其質(zhì)量控制的幾個問題做以下總結(jié)：

1 蜂膠感官的判別

農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）[1]中規(guī)定蜂膠為不透明團(tuán)塊或碎片，在35℃以上逐漸變軟，有粘性和可塑性，有明顯的芳香氣味，顏色由于樹種或生產(chǎn)季節(jié)不同呈褐色、灰褐、暗綠、灰黑色等，有光澤，有明顯的辛辣感。GB/T24283-2009《蜂膠》[7]除了對蜂膠的感官有上述描述外，還對蜂膠的乙醇提取物的感官進(jìn)行了規(guī)定。商業(yè)部頒發(fā)的《蜂膠》（SB/T10096-92）[8]、《蜂蠟》（SB/T10190-93）[9]則根據(jù)感官性狀對蜂膠進(jìn)行了分級。

2 蜂膠中黃酮類物質(zhì)的含量

蜂膠產(chǎn)品中的蜂膠含量是有一定比例的，總黃酮含量是一個標(biāo)志性成分指標(biāo)，農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）規(guī)定總黃酮含量8%，GB/T24283-2009《蜂膠》中按照總黃酮含量和乙醇提取物含量的不同對蜂膠和蜂膠乙醇提取物分了二級。《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）使用高效液相色譜法測定蜂膠中常見的高良姜素（galangin）、槲皮素（quercetin）、蘆丁（rutin）、楊梅酮（myricetin）、莰菲醇（kaempferol）、芹菜素（apigenin）、松屬素（pinocembrin）、柯因（chrysine）等8種黃酮含量，計(jì)算總和為總黃酮含量。該方法同國家質(zhì)檢總局國家蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心頒布的GB/T19427-2003[10]中的液相方法基本一致，GB/T19427-2003同時還制訂了該8種黃酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法的測定方法。GB/T24283-2009《蜂膠》則以蘆丁為對照，采用分光光度比色法測定總黃酮的含量，GB/T20574-2006[11]亦是采用分光光度比色法測定蜂膠中總黃酮的含量。

王小平等[12]用高效液相色譜法建立蜂膠指紋圖譜分析方法，用以鑒別蜂膠和樹膠，采用蜂膠黃酮類物質(zhì)中主要成分蘆丁、槲皮素、白羊素、高良姜素作為觀察指標(biāo)，方法學(xué)考察中精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)色譜圖的相似度均大于0.95。對蜂膠HPLC色譜圖進(jìn)行解析，確定有13個共有峰，構(gòu)筑了蜂膠藥材的HPLC色譜圖的指紋特征，可作為蜂膠鑒別的依據(jù)。蜂膠和樹膠同源，其主要化學(xué)成分基本相同但是相對含量有所不同，通過對10批蜂膠和3批樹膠圖譜的研究，發(fā)現(xiàn)蜂膠中有兩種成分均甚微，而3批樹膠中該兩峰均較高，以此可對真假蜂膠進(jìn)行鑒別。朱恩圓等[13]采用RP-HPLC梯度洗脫的方法對蜂膠總黃酮進(jìn)行研究，對不同產(chǎn)地的蜂膠指紋圖譜比較選出10個穩(wěn)定的且具有代表的峰作為共有峰，建立了蜂膠的指紋圖譜。沙娜等[14]應(yīng)用反相高效液相色譜法使蜂膠中各成分得到較好的分離，根據(jù)檢測結(jié)果確定了15個共有指紋峰，并指認(rèn)了其中的14個成分，分別為咖啡酸、對香豆酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、5-甲氧基短葉松素、短葉松素、喬松素、咖啡酸卞酯、5-甲氧基高良姜素、白楊素、咖啡酸苯乙基酯、高良姜素、3-甲氧基高良姜素、咖啡酸桂皮酰酯，建立蜂膠藥材指紋圖譜,對蜂膠進(jìn)行質(zhì)量控制。李熠等[15]采用超高效液相色譜法能夠同時測定蜂膠中的黃酮類物質(zhì)如蘆丁、楊梅酮、桑色素、棚皮素、茨菲醇、芹菜素、松屬素、柯因、高良姜素、金合歡素、酸類物質(zhì)如阿魏酸以及脂類物質(zhì)咖啡酸苯乙酯等12種成分的含量，提供了一種更為全面的評價(jià)蜂膠質(zhì)量的新方法。薛曉麗[16]則通過使用高效液相色譜法和氣-質(zhì)聯(lián)用分析儀將現(xiàn)代的超臨界CO2流體提取工藝與傳統(tǒng)的乙醇浸出提取工藝相比較。結(jié)果表明，兩種方法都有利于蜂膠有效化學(xué)成分的提取，乙醇浸出提取工藝有利于提取蜂膠中黃酮類物質(zhì)，超臨界CO2流體提取工藝有利于蜂膠中化學(xué)成分的分析，應(yīng)根據(jù)提取活性成分的主次及具體情況進(jìn)行選擇單體成分和指紋圖譜研究，建立指紋圖譜庫。

20世紀(jì)80年代初發(fā)展的毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間的遷移速度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)，比較HPLC測定法，高效毛細(xì)管電泳法可以更好地分離多種黃酮類化合物，并可以對糖類、有機(jī)酸類同時進(jìn)行測定[17]，與HPLC互補(bǔ)可以測定蜂膠中的芳香類化合物如酯類化合物、糖、糖醇類化合物、氨基酸、脂肪酸及黃酮類的含量。

3 蜂膠中揮發(fā)性成分的研究

蜂膠中香氣揮發(fā)性成分有萜烯類、醇、醛、酮、酯等類別，其揮發(fā)性成分是一個重要的質(zhì)量指標(biāo)，具有指紋特征。傳統(tǒng)的揮發(fā)性有機(jī)物富集方法為水蒸氣蒸餾和同時蒸餾萃取，不能滿足快速分析的要求。王小平等[18]采用GC-MS法分別對不同產(chǎn)地蜂膠乙醚索氏提取法所得提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)蜂膠的產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境等條件與蜂膠揮發(fā)油種類及含量密切相關(guān)，可考慮通過選擇蜂場附近的生態(tài)環(huán)境如主要樹木種類等，改善蜂膠產(chǎn)品的質(zhì)量。李雅萍等[19]利用固相微萃取（SPME）對蜂膠揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對提取物進(jìn)行定性定量研究，并與溶劑（乙醇、乙酸乙脂）提取法對蜂膠揮發(fā)性成分特別是萜烯類物質(zhì)的提取效果進(jìn)行了比較，建立了SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)分析蜂膠中香氣揮發(fā)性成分的方法，得到較理想的結(jié)果。利用SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)對不同產(chǎn)地采集期的蜂膠成分進(jìn)行分析，提取有用的指紋信息，為進(jìn)一步分析蜂膠某些成分的藥用價(jià)值及蜂膠的開發(fā)利用及指紋圖譜的建立提供依據(jù)。趙強(qiáng)等[20]采用超臨界CO2萃取和冷凍分離得到蜂膠揮發(fā)油，用化學(xué)發(fā)光法測定蜂膠揮發(fā)油對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除性能，并用色質(zhì)聯(lián)用法分析其化學(xué)組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠揮發(fā)油能有效抑制羥自由基和超氧陰離子自由基誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光，通過GC-MS分析鑒定出51種化合物。

4 蜂膠中蜂蠟的研究

蜂蠟在蜂膠中占3 0%～4 0%，農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）中規(guī)定蜂蠟和75%乙醇不溶物含量≤45%。該標(biāo)準(zhǔn)采用重量法測定75%乙醇可溶物含量后，采用減量法測定了蜂蠟和75%乙醇不溶物含量。駱尚驊[21]在《蜂膠質(zhì)量控制的幾個指標(biāo)和檢測方法》一文中采用索氏提取-重量法測定了蠟類含量。

5 蜂膠中酚酸類化合物的研究

有機(jī)酸成分也是蜂膠的活性成分，其含量的變化也會影響蜂膠質(zhì)量，蜂膠中的有機(jī)酸如苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、綠原酸等，具有強(qiáng)烈的抗病原微生物和保護(hù)動物肝臟的作用，與蜂膠中黃酮類物質(zhì)起協(xié)同作用。索志榮[22]采用高效液相色譜分析方法測定了蜂膠浸膏中咖啡酸、p-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、喬松素、白楊素和高良姜素7種多酚化合物的，并用該方法測定我國不同省份的9個蜂膠浸膏樣品，為評價(jià)和控制蜂膠的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。孟霞等[23]建立了高效液相色譜同時測定蜂膠中的苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、綠原酸的方法，用于實(shí)際樣品分析，取得較好結(jié)果，為測定蜂膠液中有機(jī)酸類物質(zhì)提供了方法依據(jù)。國家質(zhì)檢總局頒布了《蜂膠中阿魏酸含量的測定方法液相色譜-紫外檢測法》GB/T23196-2008[24]。周立東等[25]則采用弱堿溶解蜂膠再酸化萃取的方法純化樣品，用返滴法測定，以水楊酸作為對照品檢測樣品中游離酸含量，結(jié)果測定了5個不同產(chǎn)地的蜂膠樣品的游離酸含量，方法操作簡單，有助于蜂膠質(zhì)量的鑒別。賀崢嶸等[26]則采用紫外分光光度儀、傅立葉變換紅外光譜儀以及核磁共振譜儀等不同分析技術(shù)對貴州蜂膠中的有機(jī)酸成分進(jìn)行了研究。HROBONOVA Katarina等[27]采用在線固相萃取-液相色譜法測定了蜂膠中芥草酸、奎尼酸、綠原酸、迷迭香酸、對羥基苯甲酸等有機(jī)酚酸類物質(zhì)，只有對羥基苯甲酸沒有檢出。

6 氧化時間

國內(nèi)外大量的科學(xué)研究證明，蜂膠對機(jī)體的諸多保健功效與其抗氧化活性有著密切的關(guān)系。因此，蜂膠的抗氧化活性特別受到研究者的關(guān)注和重視。農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）、商業(yè)部頒發(fā)的《蜂膠》（SB/T10096-92）《蜂蠟》（SB/T10190-93）以及國家質(zhì)檢總局頒布的《蜂膠》（GB/T24283-2009）均對氧化時間進(jìn)行了規(guī)定，并提供了相應(yīng)的檢測方法。

7 其他方面

資料表明，還可以對蜂膠的灰分、酶活力、維生素、微量元素以及礦物質(zhì)進(jìn)行分析測定[21,28～31]。對于蜂膠浸提液，還應(yīng)增加乙醇含量和比重[32]的檢測，從而使蜂膠質(zhì)量的控制更加全面。

8 有毒有害物質(zhì)

在蜂膠質(zhì)量評定中，不僅要對蜂膠的感官性狀進(jìn)行觀察、對天然活性成分進(jìn)行分析檢測，還要把有毒物的殘留如鉛、砷、汞、鎘等重金屬污染和農(nóng)藥殘留以及霉菌、致病菌等指標(biāo)也應(yīng)作為質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）對蜂膠中的微生物指標(biāo)及檢驗(yàn)方法、重金屬指標(biāo)及檢驗(yàn)方法、農(nóng)藥殘留指標(biāo)及檢驗(yàn)方法均進(jìn)行了規(guī)范。國家質(zhì)檢總局頒發(fā)了GB/T23870-2009[33]，采用微波消解-石墨爐原子吸收分光光度法測定蜂膠中的鉛。已有研究證明，利用固相萃取法處理樣品，電子捕獲-氣相色譜法測定了蜂膠中17種有機(jī)氯殺蟲劑，定量限在2.6～38.1μg/kg之間，平均回收率為62.6～109.6%，RSD%為0.8～9.4%，4,4′-DDE在很多種峰膠中被檢出。