蜂膠活性成分及質量控制的研究進展

北京市保健品化妝品技術審評中心（100055） 李強 劉東紅

蜂膠（propolis）是蜜蜂從植物芽孢或樹干破皮傷處采集來的樹脂（樹膠），并混入蜜蜂上顎腺的分泌物，與蜂蠟、少量花粉等加工而成的一種具有芳香氣味和黏性的膠狀固體物質[1]。蜂膠是蜜蜂用于維持整個群體健康的有效物質，一個5～6萬只的蜂群一年只能生產蜂膠100～150g，被譽為“紫色黃金”。蜂膠因其化學成分復雜且生物學活性廣泛而成為國內外研究與開發的熱點。

天然蜂膠的基本成份： 樹脂50%～55%，蜂蠟30%～40%，花粉5%～10%。主要活性成分有黃酮類化合物（槲皮素、蘆丁、山奈黃素、白楊黃素、芹菜素、高良姜素、松屬素等）、萜烯類、有機酸（阿魏酸、咖啡酸、苯甲酸等）、脂肪酸（10-羥基-α-癸烯酸等）、氨基酸、胰蛋白酶等活性酶類、維生素、多糖、30多種微量元素和礦物質等共200余種有效成分[2][3]。

蜂膠具有抗感染、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗輻射；降血脂、降血糖、降血壓、降膽固醇；增強免疫、清除自由基、美容、促進組織再生等作用[4][6]。蜂膠在臨床內科、外科、皮膚科、耳鼻喉科、婦科、內分泌及代謝性疾病等均有應用[5][6]。

蜂膠制品有兩類，一類是以水為載體的，即所謂水溶性蜂膠；另一類是以酒精為載體的，即所謂醇溶或酒精溶的蜂膠。原膠（即從蜂箱中直接取出的蜂膠）中含有雜質，而且重金屬含量較高，不能直接食用，必須經過提純、去雜、去除重金屬如鉛等之后，才可用于加工生產各種蜂膠制品。蜂膠的活性成分因產地、氣候、儲存方式、提取工藝的不同而不同，從而使蜂膠質量和功效存在差異。

蜂膠的質量控制貫穿于收購和加工的全過程，隨著現代各種檢測技術的不斷發展，特別是近年來色譜技術的日益發展、檢測手段和能力的不斷增強，為蜂膠中有效成分含量測定的研究提供了良好的工作平臺。采用先進的現代分析技術色譜、光譜、電泳技術以及聯用技術，如氣相色譜-質譜聯用技術、高效毛細管電泳-質譜聯用技術和高效液相色譜-質譜聯用技術，通過現代儀器分析方法，分析蜂膠中的有效成分和特有的芳香物質，建立起相應的科學的質量技術評價平臺和質量標準評價平臺，最終推廣到行業應用，從而確保蜂膠質量穩定可控，使蜂膠這一寶貴的資源能更好地造福于人類?，F對蜂膠活性成分及其質量控制的幾個問題做以下總結：

1 蜂膠感官的判別

農業部頒發的標準《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）[1]中規定蜂膠為不透明團塊或碎片，在35℃以上逐漸變軟，有粘性和可塑性，有明顯的芳香氣味，顏色由于樹種或生產季節不同呈褐色、灰褐、暗綠、灰黑色等，有光澤，有明顯的辛辣感。GB/T24283-2009《蜂膠》[7]除了對蜂膠的感官有上述描述外，還對蜂膠的乙醇提取物的感官進行了規定。商業部頒發的《蜂膠》（SB/T10096-92）[8]、《蜂蠟》（SB/T10190-93）[9]則根據感官性狀對蜂膠進行了分級。

2 蜂膠中黃酮類物質的含量

蜂膠產品中的蜂膠含量是有一定比例的，總黃酮含量是一個標志性成分指標，農業部頒發的標準《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）規定總黃酮含量8%，GB/T24283-2009《蜂膠》中按照總黃酮含量和乙醇提取物含量的不同對蜂膠和蜂膠乙醇提取物分了二級。《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）使用高效液相色譜法測定蜂膠中常見的高良姜素（galangin）、槲皮素（quercetin）、蘆?。╮utin）、楊梅酮（myricetin）、莰菲醇（kaempferol）、芹菜素（apigenin）、松屬素（pinocembrin）、柯因（chrysine）等8種黃酮含量，計算總和為總黃酮含量。該方法同國家質檢總局國家蜂產品質量監督檢驗中心頒布的GB/T19427-2003[10]中的液相方法基本一致，GB/T19427-2003同時還制訂了該8種黃酮的液相色譜-串聯質譜檢測法的測定方法。GB/T24283-2009《蜂膠》則以蘆丁為對照，采用分光光度比色法測定總黃酮的含量，GB/T20574-2006[11]亦是采用分光光度比色法測定蜂膠中總黃酮的含量。

王小平等[12]用高效液相色譜法建立蜂膠指紋圖譜分析方法，用以鑒別蜂膠和樹膠，采用蜂膠黃酮類物質中主要成分蘆丁、槲皮素、白羊素、高良姜素作為觀察指標，方法學考察中精密度試驗、重復性試驗、穩定性試驗色譜圖的相似度均大于0.95。對蜂膠HPLC色譜圖進行解析，確定有13個共有峰，構筑了蜂膠藥材的HPLC色譜圖的指紋特征，可作為蜂膠鑒別的依據。蜂膠和樹膠同源，其主要化學成分基本相同但是相對含量有所不同，通過對10批蜂膠和3批樹膠圖譜的研究，發現蜂膠中有兩種成分均甚微，而3批樹膠中該兩峰均較高，以此可對真假蜂膠進行鑒別。朱恩圓等[13]采用RP-HPLC梯度洗脫的方法對蜂膠總黃酮進行研究，對不同產地的蜂膠指紋圖譜比較選出10個穩定的且具有代表的峰作為共有峰，建立了蜂膠的指紋圖譜。沙娜等[14]應用反相高效液相色譜法使蜂膠中各成分得到較好的分離，根據檢測結果確定了15個共有指紋峰，并指認了其中的14個成分，分別為咖啡酸、對香豆酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、5-甲氧基短葉松素、短葉松素、喬松素、咖啡酸卞酯、5-甲氧基高良姜素、白楊素、咖啡酸苯乙基酯、高良姜素、3-甲氧基高良姜素、咖啡酸桂皮酰酯，建立蜂膠藥材指紋圖譜,對蜂膠進行質量控制。李熠等[15]采用超高效液相色譜法能夠同時測定蜂膠中的黃酮類物質如蘆丁、楊梅酮、桑色素、棚皮素、茨菲醇、芹菜素、松屬素、柯因、高良姜素、金合歡素、酸類物質如阿魏酸以及脂類物質咖啡酸苯乙酯等12種成分的含量，提供了一種更為全面的評價蜂膠質量的新方法。薛曉麗[16]則通過使用高效液相色譜法和氣-質聯用分析儀將現代的超臨界CO2流體提取工藝與傳統的乙醇浸出提取工藝相比較。結果表明，兩種方法都有利于蜂膠有效化學成分的提取，乙醇浸出提取工藝有利于提取蜂膠中黃酮類物質，超臨界CO2流體提取工藝有利于蜂膠中化學成分的分析，應根據提取活性成分的主次及具體情況進行選擇單體成分和指紋圖譜研究，建立指紋圖譜庫。

20世紀80年代初發展的毛細管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）是以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據樣品中各組分之間的遷移速度和分配行為上的差異而實現分離的一類液相分離技術，比較HPLC測定法，高效毛細管電泳法可以更好地分離多種黃酮類化合物，并可以對糖類、有機酸類同時進行測定[17]，與HPLC互補可以測定蜂膠中的芳香類化合物如酯類化合物、糖、糖醇類化合物、氨基酸、脂肪酸及黃酮類的含量。

3 蜂膠中揮發性成分的研究

蜂膠中香氣揮發性成分有萜烯類、醇、醛、酮、酯等類別，其揮發性成分是一個重要的質量指標，具有指紋特征。傳統的揮發性有機物富集方法為水蒸氣蒸餾和同時蒸餾萃取，不能滿足快速分析的要求。王小平等[18]采用GC-MS法分別對不同產地蜂膠乙醚索氏提取法所得提取物的化學成分進行分析比較，發現蜂膠的產地、生態環境等條件與蜂膠揮發油種類及含量密切相關，可考慮通過選擇蜂場附近的生態環境如主要樹木種類等，改善蜂膠產品的質量。李雅萍等[19]利用固相微萃?。⊿PME）對蜂膠揮發性成分進行提取，采用氣相色譜-質譜聯用技術對提取物進行定性定量研究，并與溶劑（乙醇、乙酸乙脂）提取法對蜂膠揮發性成分特別是萜烯類物質的提取效果進行了比較，建立了SPME-GC/MS聯用技術分析蜂膠中香氣揮發性成分的方法，得到較理想的結果。利用SPME-GC/MS聯用技術對不同產地采集期的蜂膠成分進行分析，提取有用的指紋信息，為進一步分析蜂膠某些成分的藥用價值及蜂膠的開發利用及指紋圖譜的建立提供依據。趙強等[20]采用超臨界CO2萃取和冷凍分離得到蜂膠揮發油，用化學發光法測定蜂膠揮發油對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除性能，并用色質聯用法分析其化學組成。實驗結果表明，蜂膠揮發油能有效抑制羥自由基和超氧陰離子自由基誘導的化學發光，通過GC-MS分析鑒定出51種化合物。

4 蜂膠中蜂蠟的研究

蜂蠟在蜂膠中占3 0%～4 0%，農業部頒發的標準《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）中規定蜂蠟和75%乙醇不溶物含量≤45%。該標準采用重量法測定75%乙醇可溶物含量后，采用減量法測定了蜂蠟和75%乙醇不溶物含量。駱尚驊[21]在《蜂膠質量控制的幾個指標和檢測方法》一文中采用索氏提取-重量法測定了蠟類含量。

5 蜂膠中酚酸類化合物的研究

有機酸成分也是蜂膠的活性成分，其含量的變化也會影響蜂膠質量，蜂膠中的有機酸如苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、綠原酸等，具有強烈的抗病原微生物和保護動物肝臟的作用，與蜂膠中黃酮類物質起協同作用。索志榮[22]采用高效液相色譜分析方法測定了蜂膠浸膏中咖啡酸、p-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、喬松素、白楊素和高良姜素7種多酚化合物的，并用該方法測定我國不同省份的9個蜂膠浸膏樣品，為評價和控制蜂膠的質量提供科學依據。孟霞等[23]建立了高效液相色譜同時測定蜂膠中的苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、綠原酸的方法，用于實際樣品分析，取得較好結果，為測定蜂膠液中有機酸類物質提供了方法依據。國家質檢總局頒布了《蜂膠中阿魏酸含量的測定方法液相色譜-紫外檢測法》GB/T23196-2008[24]。周立東等[25]則采用弱堿溶解蜂膠再酸化萃取的方法純化樣品，用返滴法測定，以水楊酸作為對照品檢測樣品中游離酸含量，結果測定了5個不同產地的蜂膠樣品的游離酸含量，方法操作簡單，有助于蜂膠質量的鑒別。賀崢嶸等[26]則采用紫外分光光度儀、傅立葉變換紅外光譜儀以及核磁共振譜儀等不同分析技術對貴州蜂膠中的有機酸成分進行了研究。HROBONOVA Katarina等[27]采用在線固相萃取-液相色譜法測定了蜂膠中芥草酸、奎尼酸、綠原酸、迷迭香酸、對羥基苯甲酸等有機酚酸類物質，只有對羥基苯甲酸沒有檢出。

6 氧化時間

國內外大量的科學研究證明，蜂膠對機體的諸多保健功效與其抗氧化活性有著密切的關系。因此，蜂膠的抗氧化活性特別受到研究者的關注和重視。農業部頒發的標準《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）、商業部頒發的《蜂膠》（SB/T10096-92）《蜂蠟》（SB/T10190-93）以及國家質檢總局頒布的《蜂膠》（GB/T24283-2009）均對氧化時間進行了規定，并提供了相應的檢測方法。

7 其他方面

資料表明，還可以對蜂膠的灰分、酶活力、維生素、微量元素以及礦物質進行分析測定[21,28～31]。對于蜂膠浸提液，還應增加乙醇含量和比重[32]的檢測，從而使蜂膠質量的控制更加全面。

8 有毒有害物質

在蜂膠質量評定中，不僅要對蜂膠的感官性狀進行觀察、對天然活性成分進行分析檢測，還要把有毒物的殘留如鉛、砷、汞、鎘等重金屬污染和農藥殘留以及霉菌、致病菌等指標也應作為質量控制的重要指標。農業部頒發的標準《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）對蜂膠中的微生物指標及檢驗方法、重金屬指標及檢驗方法、農藥殘留指標及檢驗方法均進行了規范。國家質檢總局頒發了GB/T23870-2009[33]，采用微波消解-石墨爐原子吸收分光光度法測定蜂膠中的鉛。已有研究證明，利用固相萃取法處理樣品，電子捕獲-氣相色譜法測定了蜂膠中17種有機氯殺蟲劑，定量限在2.6～38.1μg/kg之間，平均回收率為62.6～109.6%，RSD%為0.8～9.4%，4,4′-DDE在很多種峰膠中被檢出。