白細胞介素12的研究概況與進展

王 燦，黎曉敏，彭遠義

（西南大學動物科技學院，重慶 北碚 400716）

細胞因子是由細胞分泌的一類能在細胞間傳遞信息、具有多種生物學效應(yīng)的蛋白質(zhì)或小分子多肽，主要包括干擾素、腫瘤壞死因子、白細胞介素和集落刺激因子等。IL-12是1990年由美國的Stern等人發(fā)現(xiàn)的一個細胞因子，最初根據(jù)其生物學基本功能將它稱為自然殺傷細胞刺激因子或細胞毒性淋巴細胞成熟因子。1991年Gubler等成功克隆表達了CLMFcDNA，并將其命名為白細胞介素-12（IL-12）。此后學者們研究發(fā)現(xiàn)IL-12具有多種生物學活性，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗感染等方面具有很重要的作用，顯示了它作為免疫佐劑應(yīng)用于疫苗中的前景。本文從IL-12的分子結(jié)構(gòu)及特點、產(chǎn)生及來源、生物學功能、臨床應(yīng)用現(xiàn)狀和基因的克隆與表達等幾個方面作如下綜述。

1 IL-12的分子結(jié)構(gòu)及特點

具有生物活性的天然IL-12是一種分子量為75kD的糖蛋白，是由40kD和35kD兩個亞基（p40和p35）依靠二硫鍵組成的異二聚體（p70），也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一由兩個不同亞基組成并呈異二聚體結(jié)構(gòu)的細胞因子，也就是說p35和p40兩者單獨存在時無生物學作用，只有以異二聚體方式結(jié)合為p70后才具有生物學活性。除具生物活性的異二聚體p70外，IL-12還能以（p40）2同聚物形式被過量分泌，它是p70的天然拮抗劑，能與IL-12受體結(jié)合從而阻斷p70與受體結(jié)合發(fā)揮生物活性。IL-12中的p40基因定位于染色體5q31-33，p35基因位于染色體3q12-13.2。

蘭文升等于2002年在國內(nèi)首次克隆了豬IL-12。序列分析表明p35基因開放閱讀框序列與人、小鼠和羊的同源性分別為79.2%、37.6%、86.1%，p40基因開放閱讀框序列與人、小鼠和羊的同源性分別為79.5%、53.1%、84.3%。Dante等于1995年擴增了編碼牛IL-12的cDNA序列，分析后表明牛p40和p35亞基的氨基酸序列與人和小鼠的同源性分別為84.4%、67.6%和82.2%、58.6%。由以上可知，IL-12在各種屬間的同源性普遍較低，因此存在種屬特異性。

2 IL-12的產(chǎn)生及來源

IL-12主要由單核細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，部分來自樹突狀細胞、中性粒細胞、郎格罕氏細胞等。有研究表明，在很多組織中如淋巴組織（脾、胸腺、骨髓）、非淋巴組織（肝、腎、肌肉）均能表達IL-12，而在受到刺激的淋巴組織中可見IL-12的高水平表達。在體外條件下，LPS、ConA、PHA能誘導(dǎo)脾細胞和外周血單核細胞產(chǎn)生IL-12。A.Premraj等（2006）發(fā)現(xiàn)p35和p40亞基均可在脾臟細胞中表達，但p40亞基的表達量在脾臟受到刺激后8～24h內(nèi)有所升高，而p35亞基的表達量沒有波動。

3 IL-12的生物學功能

3.1 對T、NK等免疫細胞的調(diào)節(jié)作用 IL-12能增強NK/LA K細胞的溶菌活性，作為活化的T細胞和NK細胞的生長因子促進T細胞和NK細胞增殖。IL-12可明顯刺激靜止的或激活外周血T淋巴細胞、NK細胞分泌IFN-γ，并與IL-12協(xié)同作用，但靜止的細胞需要輔助T細胞的參與。IFN-γ的產(chǎn)生反過來活化巨噬細胞產(chǎn)生更多的IL-12，形成二者的正反饋途徑，共同調(diào)節(jié)細胞亞群分化。IL-12還能促進T細胞表達CD40L，使T細胞通過CD40L與B細胞上的CD40L相互作用，從而促進B細胞的分裂增殖；同時IL-12可使增殖的B細胞分化為漿細胞并分泌IgM，增強體液免疫。

3.2 對Th1細胞的誘導(dǎo)和對Th2細胞的抑制作用 在人體和鼠，已證明IL-12是Th1產(chǎn)生的必需因子，它可促進Th1細胞的分化和功能的提高，同時抑制由IL-4介導(dǎo)的Th2細胞的分化。在體外用過敏原作用于CD4+細胞后生成Th2型細胞，后者可分泌高濃度IL-4和低濃度IFN-γ；但當有IL-12存在時，則生成Th1細胞，只分泌IFN-γ，而不分泌IL-4。因此，IL-12和IL-4分別支持Th1和Th2細胞的分化。通過一定的正負反饋調(diào)節(jié)機制，Th1細胞分泌的IFN-γ可進一步增加單核細胞產(chǎn)生IL-12，減少IL-10產(chǎn)生；Th2分泌的IL-4和IL-10則抑制IL-12的產(chǎn)生。另外，IFN-γ可增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性，并通過抑制Th2細胞下調(diào)體液免疫，使Th細胞的分化向Th1方向進行。Th1細胞在細胞免疫中尤其是在宿主抗胞內(nèi)細菌感染中起重要作用。由此可見，IL-12通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，在細胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮了積極作用。

4 IL-12的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 抗腫瘤 IL-12增強NK細胞和CTL細胞的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生IFN-γ，表明它可能具有抗腫瘤作用。目前應(yīng)用IL-12基因治療黑色素瘤、乳腺癌、腎癌、消化道惡性腫瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤等晚期腫瘤已在臨床I、II期中可見，并取得了一定的療效，且未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。

Lenoard等（1997）用rhIL-12進行I期臨床試驗，在腫瘤和感染患者中按劑量遞增給予IL-12，結(jié)果顯示rhIL-12在500 ng/kg時安全。但在II期臨床試驗中，12例患者中出現(xiàn)2人死亡，說明藥物的耐受性與劑量有關(guān)。Portielje等通過對晚期腎癌患者使用rhIL-12進行臨床Ⅰ期研究，觀察到相同劑量時首次注射的不良反應(yīng)要比再次注射嚴重。rhIL-12首次給藥的最大耐受劑量（MTD）是500ng/kg，再次給藥的MTD是1000mg/kg。在治療過程中，第1d使用rhIL-12后間隔7d，到第8d開始重復(fù)使用rhIL-12，每周3次，連續(xù)2周，活檢顯示IL-12和IFN-γ在血中的濃度上升，證明瘤內(nèi)注射質(zhì)粒DNA產(chǎn)生了有益的臨床效果。在最近的研究中，將IL-12基因與其他基因聯(lián)合應(yīng)用，通過相互間的協(xié)同或疊加效應(yīng)來治療腫瘤，這已成為一個重要的發(fā)展方向。

4.2 抗病毒感染 IL-12對多種類型病毒的復(fù)制和表達都具有抑制作用，它可通過增強病毒感染后的特異性和非特異性免疫應(yīng)答來發(fā)揮抗病毒作用。IL-12可以增強病毒感染組織中MHCⅠ、Ⅱ類抗原的表達，而由IL-12刺激的NK細胞和CTL細胞對病毒感染細胞清除的第一步即是對MHC限制性病毒感染細胞的識別，因此IL-12是調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子。杜德偉等用HBV DNA疫苗（PCR3.1-S）與編碼小鼠IL-12的真核表達載體共同免疫小鼠，然后測定CTL細胞殺傷活性，結(jié)果顯示有IL-12組的CTL殺傷活性顯著高于無IL-12組。說明IL-12的真核表達載體能提高小鼠對HBV DNA疫苗的免疫應(yīng)答，可以用于抵御乙型肝炎病毒的感染。

4.3 抗寄生蟲 因IL-12能夠誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)向Th1型優(yōu)勢分化，在細胞免疫中起重要作用，所以在抗血吸蟲感染方面也有重要作用。喻鑫玲等用SjCTPIHsp70與IL-12聯(lián)合免疫水牛，對于水牛血吸蟲的感染有一定的免疫保護性作用。

5 IL-12基因的克隆與表達

p35和p40兩者單獨存在時無生物學作用，只有以異二聚體方式等比例結(jié)合后才具有生物學活性。許多研究者為解決該問題，在IL-12克隆表達時采取了不同策略以實現(xiàn)雙亞基的同步表達。到目前為止，人、鼠、牛、豬等多種動物的IL-12均已可以通過病毒、質(zhì)粒等載體在原核與真核表達系統(tǒng)中表達，且具有生物活性，為IL-12在免疫和治療方面的應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

夏向文等采用重疊PCR的方法成功構(gòu)建了攜帶報告基因（GFP）和人IL-12 p35、p40亞基基因的重組真核質(zhì)粒pEGFP-C1_IL-12，并在人肝癌細胞系HepG2中成功表達。他們首先分別擴增出p35和p40亞基基因，設(shè)計兩亞基引物時在p40的下游引物和p35的上游引物中分別加入p35和p40的部分互補序列，從而實現(xiàn)了采用重疊PCR的方法連接兩個亞基基因得到全長串聯(lián)基因的目的。

理想的基因轉(zhuǎn)移載體是IL-12在臨床中進一步應(yīng)用的關(guān)鍵。病毒載體的轉(zhuǎn)染效率高，但制備成本也高，過程煩瑣，且體內(nèi)免疫原性強，妨礙載體的重復(fù)注射。相比之下質(zhì)粒載體成本低且制備簡便，但其轉(zhuǎn)染效率相對較低。考慮到如上問題，李曉敏等利用1999年出現(xiàn)的水流動力學注射方法將表達小鼠IL-12的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，從而解決了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低的問題。

6 應(yīng)用前景

傳統(tǒng)的疫苗免疫手段仍然存在問題，比如弱毒疫苗存在可能的安全問題，滅活疫苗雖然安全但其免疫效力不甚理想，DNA疫苗具有良好的發(fā)展前途但仍需不斷完善。IL-12因其獨特的免疫調(diào)節(jié)作用，十分適合作為免疫佐劑改良現(xiàn)有的DNA疫苗，尤其針對細胞免疫，對提高機體抗感染能力的效果良好。另外，IL-12也可用于對腫瘤等疾病的治療，但治療時的用量、使用時間等都有待進一步研究。

[1]Boyer JD，Cohen AD，et al.Therapeutic immunization of HIV-infected chimpanzees using HIV-1 plasmid antigens and interleukin-12 expressing plasmids[J].AIDS，2000，14：1515-1522.

[2]Yu DS，Lee CF，Hsieh DS，et al.Antitumor effects of recombinant BCG and interleukin-12 DNA vaccines on xenografted mutine bladder cancer[J].Urology，2004，63（3）：596-601.

[3]Knutson KL，Disis ML.IL-12 enhances the generation of tumour antigen-specific Th1 CD4 T cells during exvivo expansion[J].Clin Exp Immunol，2004，135（2）：322-329.

[4]蘭文升，童光志，仇華吉.豬白細胞介素12的分子克隆與序列測定[J].動物醫(yī)學進展，2002，23（1）：38-41.

[5]鄭華寧，甘 慧，周大興.白細胞介素12的生物學功能與藥理學作用 [J].國際醫(yī)學研究雜志，2008，35（3）：194-197.

[6]杜德偉.白細胞介素12提高HBV基因疫苗的免疫應(yīng)答[J].中國免疫學雜志，2001，17（4）：183-185.

[7]喻鑫玲，何永康，熊 鐵，等.日本血吸蟲SjCTPI-Hsp70 DNA疫苗與白細胞介素12對水牛的聯(lián)合免疫保護作用研究[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2006，24（6）：433-436.

[8]ZHU Xiao-hua，et al.The adjuvant effect of IL-12 on protective immunity of schistosoma japonicum fatty acid binding protein（Sj14FABP）[J].Chin J Parasitol Parasit Dis.，2005，23（3）：150-154.

[9]夏向文.雙亞基共表達重組人白細胞介素12真核質(zhì)粒pEGFP-C1_IL-12的構(gòu)建及表達[J].華中科技大學學報（醫(yī)學版），2009，38（1）：83-86.

[10]李曉敏，等.水流動力學注射介導(dǎo)的IL-12基因在小鼠體內(nèi)的高效表達 [J].中國免疫學雜志，2007，23（12）：1064-1068，1070.