食管癌組織中ABCG2的表達變化及意義

羅俊輝,鄒良健＊,黃盛東,龔德軍,劉廣洛,馬春生

(1第二軍醫大學長海醫院,上海 200433;2中國人民解放軍第 150中心醫院)

ABCG2作為一種重要的腫瘤多藥耐藥蛋白,不僅在腫瘤的多藥耐藥中發揮作用,而且還是腫瘤干細胞的候選標記物[1]。對其在腫瘤細胞中的分布及作用進行研究具有重要意義。本研究觀察了食管癌組織中ABCG2的表達變化,并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 標本收集 80例新鮮食管癌及癌旁正常食管組織來源于長海醫院胸心外科2006年 1月 ～2007年1月行食管癌根治術的患者(所取標本均經患者知情同意),術后均經病理學檢查確診。手術切除腫瘤標本5m in內,用無菌手術刀片切取數塊1 cm×1 cm ×1 cm的腫瘤組織(避開壞死部分)和距腫瘤組織盡量遠的正常食管組織,立即置于液氮中保存。患者均行電話隨訪,了解術后生存時間(至2009年1月)。

1.2 ABCG2檢測 ①免疫組化染色：將組織從液氮中取出,常規石蠟包埋及切片,HE染色。用Envision法行ABCG2的免疫組化染色：切片置入0.01 M檸檬酸鹽緩沖液中,煮沸 20min修復抗原,血清封閉液封閉20min,一抗采用抗兔ABCG2單克隆抗體,DAB顯色,蘇木精襯染,封片后在顯微鏡下觀察。不加一抗作空白對照,人胎盤作陽性對照。ABCG2陽性表達為細胞膜及細胞質內有棕黃色顆粒。利用數碼相機拍攝切片的高倍視野(×400)病理照片,在電腦上計數ABCG2陽性細胞。每個病例取3張切片(正常組織和癌組織各 3張),每張切片取 5個高倍鏡視野計數陽性細胞數,取其平均數(每高倍視野),并按照以下標準確定該例的ABCG2分級：無陽性細胞為-(0級),陽性細胞1～30個為+(1級)、31～60個為++(2級)、61～90個為+++(3級)、90個為++++(4級),這樣80例病例均得出癌組織和正常組織的ABCG2分級,然后計算出80例癌組織的ABCG2平均分級。②West-ern blot檢測：采用ODG buffer裂解法提取組織蛋白質,用10%分離膠及 4%濃縮膠,100 V電泳約100 min,轉移至PVDF膜,封閉液封閉,放置過夜;次日加稀釋ABCG2一抗(1∶1 000)、內參一抗(1∶400),溫育1.5 h,TBSB清洗3次后加二抗(1∶4 000),溫育1.5 h后化學發光、顯影、定影。用UVP凝膠成像系統Labworks4.6軟件分析目標蛋白條帶的灰度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。用配對t檢驗確定ABCG2在食管癌及癌旁正常食管組織中的差異,用χ2檢驗及Wilcoxon秩和檢驗分析ABCG2的表達與食管癌臨床病理參數的關系。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織分型 所有標本均經HE染色確定病變類型,并明確正常組織無腫瘤侵犯。高分化鱗癌 22例,中分化鱗癌 48例,低分化鱗癌 10例。

2.2 免疫組化檢測ABCG2在食管癌組織中的表達在正常食管組織中,ABCG2主要位于食管上皮的棘細胞層,為連續性,以胞膜著色為主;在癌組織中, ABCG2多為巢團狀分布,主要定位于癌細胞,尤其定位于癌巢的中心部位及正在分裂的細胞,胞膜及胞質均有著色,在癌組織的血管內皮也可見有ABCG2表達。有40例癌組織檢測到ABCG2(占50%),而在癌旁正常食管組織中有 27例檢測到ABCG2(占33.75%),兩者相比,P＜0.05。癌組織ABCG2表達的分級為0.84±0.99級,正常食管組織為0.43±0.73級,兩者相比,P＜0.05。在低分化的食管癌組織中,ABCG2的表達較高、中分化食管癌的ABCG2表達升高,但兩者相比,P＞0.05。

2.3 Western blot檢測ABCG2在食管癌中的表達80例食管癌組織與正常組織中ABCG2和β-actin產物條帶積分光密度值之比分別為0.37±0.19和0.30±0.15,ABCG2在癌組織中的表達水平為正常組織的1.22倍,兩者相比,P＜0.05。

2.4 ABCG2的表達與食管癌患者預后的關系 ①免疫組化染色結果表明,術后3 a之內死亡的患者癌組織中 ABCG2的表達量較生存組患者高(ABCG2表達-、+、++、+++、++++者死亡組分別為 11、17、8、5、2例,生存組分別為 29、6、1、1、0例),即患者的3年生存率與ABCG2的表達程度有關(P＜0.01)。ABCG2在癌組織中的表達量與癌病變位置、TNM分期以及患者的性別、年齡無關(P均＞0.05)。②Western blot結果表明,食管癌組織中ABCG2表達上調(T/N＞1)與患者的術后早期復發密切相關(T/N＞1者61例,其中術后早期復發27例、未復發34例;T/N＜1者19例,其中早期復發2例、未復發 17例;兩者相比,P＜0.01),而與患者年齡、性別、病程、病變部位、病理分型、TNM分期、分化程度及與患者是否接受術前化療等無關(P均＞0.05)。

3 討論

造成食管癌手術治療失敗的主要原因是術后復發。而造成食管癌術后復發的主要原因是體內殘存癌細胞,包括在局部的癌細胞殘留和未被發現的淋巴結轉移。盡管手術加術后化療在理論上可以清除所有癌細胞,但由于腫瘤的耐藥導致部分癌細胞無法被清除,而成為腫瘤復發的根源。

ABCG2是介導腫瘤多藥耐藥的一個基因,分布于許多正常組織及腫瘤中。在正常組織中高表達于胎盤合體滋養層、小腸、大腸上皮、腦和前列腺等,而在乳腺、肝臟、肺等組織中低表達(局部有高表達)。其同樣存在于乳腺癌、胃癌、大腸癌、子宮內膜癌、卵巢癌及肺癌等實體瘤中[2,3]。表達 ABCG2的細胞對米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、拓撲替康、sN-38(伊立替康的活性代謝物)等藥物耐藥,但其對長春新堿、紫杉醇和順鉑依然敏感[4]。ABCG2在毛細血管或小靜脈內皮細胞中的表達可能會對Western blot或PCR的檢測結果造成干擾,用免疫組化的方法可以確定腫瘤組織中ABCG2的表達并非是毛細血管或小靜脈內皮細胞的作用,而是組織本身的表達。

與其他的大部分ABC轉運蛋白不同,ABCG2除了作為細胞耐藥的藥物轉運蛋白,還與干細胞及腫瘤干細胞的功能及鑒定密切相關[5]。本研究免疫組化結果表明,ABCG2主要分布于食管癌增生活躍的部位,而且在食管癌組織中表達的高低與患者的中期生存率有關。患者手術后的中期生存率和患者體內殘存的癌細胞的增殖及轉移速度有關。高表達ABCG2的患者較低表達患者的中期生存率低,復發率則較低表達ABCG2的食管癌患者要高,說明ABCG2在食管癌的轉移及復發中扮演了重要的角色。這種作用的形成可能與ABCG2本身是一種耐藥蛋白有關,他的升高也伴隨著食管癌耐藥性的升高,導致癌細胞對多種化療藥物產生耐藥性。但ABCG2并不轉運當前食管癌中常用的鉑類,因此,患者預后差很可能和 ABCG2的其他特性有關。ABCG2本身并不單純是一種耐藥蛋白,它還是一種潛在的腫瘤干細胞標志物。研究發現,SP陽性細胞較SP陰性細胞高表達ABCG2,高表達ABCG2的癌細胞很可能是腫瘤干細胞[1,6,7,8]。腫瘤干細胞與腫瘤的發生、轉移、復發等密切相關,且腫瘤干細胞是天然耐藥的。在其他的一些腫瘤的研究中已經有類似的報道,如在多形性膠質細胞瘤的研究中,ABCG2陽性癌細胞較ABCG2陰性癌細胞的增殖速度和侵襲能力均有明顯上調[9]。因此,在食管癌中, ABCG2的高表達說明腫瘤組織中可能存在有較多量的腫瘤干細胞,其增殖能力和侵襲能力較ABCG2陰性細胞升高,同時其耐藥性也較ABCG2陰性細胞明顯升高,導致腫瘤的早期轉移及復發,降低患者的生存率。因此,ABCG2可以作為食管癌患者預后的預測因子之一。

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