人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)效果觀察

李德華,單 偉

(遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,遼寧錦州 120001)

周圍神經(jīng)損傷后的再生與修復(fù)一直是一大難題。長段周圍神經(jīng)缺損需神經(jīng)移植術(shù)來修復(fù),但自體神經(jīng)來源受限,異體神經(jīng)移植后存在免疫排斥反應(yīng)。近年來,組織工程化神經(jīng)已成為研究的熱點(diǎn)。較為理想的組織工程化神經(jīng)是由干細(xì)胞與生物材料構(gòu)建而成。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSC)具有多向分化的潛能,可表達(dá)與其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)大致相同的基因[1,2]。另外,HUMSC表達(dá)HLA-1,不表達(dá)HLA-DR、共刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和CD40,且表面尚未形成ABO和HLA抗原,缺少 T細(xì)胞活化所必需的第二信號(hào)系統(tǒng)[3,4],不會(huì)引起移植物抗宿主反應(yīng)。因此,可認(rèn)為HUMSC是一種較為理想的種子細(xì)胞。2010年 8～10月,我們觀察了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSC)移植對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的修復(fù)效果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、羊膜、細(xì)胞及主要試劑 成年健康SD大鼠 80只,體質(zhì)量 180～230 g,雌雄不限。人羊膜(取自健康、足月、順產(chǎn)的新鮮胎兒胎盤)。純化HUMSC。DF12培養(yǎng)基(Invitrogen),胰蛋白酶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人羊膜的處理、制備 無菌條件下鈍性分離胎膜內(nèi)面的羊膜,氨水消化法處理后平鋪于黑色塑料托盤上,切割成2.0 cm×2.5 cm小塊,置500 m l無菌PBS中,-20℃冷藏,使用前室溫融化。

1.2.2 HUMSC培養(yǎng) 純化的HUMSC培養(yǎng)后, PBS清洗,0.25%胰蛋白酶消化,1 000 r/m in離心5 min,去上清,加新的培養(yǎng)液,計(jì)數(shù)細(xì)胞,分裝培養(yǎng),傳至第 3～4代,用培養(yǎng)基配制 1×106/m l細(xì)胞懸液,供羊膜腔注入。

1.2.3 動(dòng)物模型的制備及觀察 80只SD大鼠以10%水合氯醛腹膜腔注射麻醉后,于其股后部做斜行25mm切口,沿股二頭肌與股外側(cè)肌之間的間隙鈍性分離,尋找、暴露、游離坐骨神經(jīng)。于梨狀肌下緣5 mm處,將已備好的羊膜搭在坐骨神經(jīng)上,10-0無損傷血管縫線于兩端神經(jīng)外膜上各縫合 1針,切除坐骨神經(jīng)6～8mm,使其自然回縮形成10mm間隙,羊膜包繞神經(jīng)斷端形成羊膜管,即坐骨神經(jīng)缺損套管模型,分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,各 40只。實(shí)驗(yàn)組從近端羊膜管進(jìn)針注入HUMSC細(xì)胞懸液,滴適量慶大霉素注射液至切口內(nèi),逐層縫合,切口縫以無菌紗布。對照組羊膜腔內(nèi)注射生理鹽水。動(dòng)物蘇醒后正常喂養(yǎng)。于 4、8、12、16、20周,每組隨機(jī)取 8只大鼠,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取術(shù)側(cè)及對側(cè)腓腸肌的肌腹中段5 mm,4%多聚甲醛固定4 h,梯度酒精脫水,香柏油過夜透明,浸蠟,石蠟包埋,5μm厚橫行切片;每隔 5張取1張,每個(gè)標(biāo)本取5張,行HE染色,觀察肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu);隨機(jī)測量 10個(gè)肌細(xì)胞最大長徑及與長徑垂直的寬徑,取均值作為肌細(xì)胞的橫徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用多因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后 4周術(shù)側(cè)腓腸肌肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不均一,8周時(shí)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不均一程度減輕,12、16、20周時(shí)肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸規(guī)整;而對照組在 4、8、12、16、 20周時(shí),術(shù)側(cè)腓腸肌萎縮程度逐漸加重,肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不均一逐漸加重。術(shù)后 4、8、12、16、20周時(shí),實(shí)驗(yàn)組術(shù)側(cè)腓腸肌肌細(xì)胞直徑分別為(13.21±0.63)、(12.21±0.43)、(14.18±0.60)、(19.07±1.44)、(24.39±1.18)μm,對照組術(shù)側(cè)分別為(12.77 ±0.62)、(10.75±0.57)、(5.85±0.47)、(4.45 ±0.77)、(4.36±0.65)μm;與兩組手術(shù)對側(cè)腓腸肌肌細(xì)胞直徑的(31.466±0.726)μm相比,P均＜0.01;兩組同時(shí)間點(diǎn)相比,P均＜0.01;實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)相比,P均＜0.05。

3 討論

人羊膜具有引導(dǎo)神經(jīng)再生的功能。經(jīng)過處理的人羊膜細(xì)胞外基質(zhì)由LN、FN、Ⅳ型膠原及硫酸乙酞肝素、蛋白多糖、其他一些蛋白多糖大分子物質(zhì)構(gòu)成,與周圍神經(jīng)雪旺細(xì)胞基底膜成分類似,但不含細(xì)胞成分,因此抗原性極低,其產(chǎn)生的多種生物活性成分又為周圍神經(jīng)再生軸索生長提供了接觸引導(dǎo)的物質(zhì)基礎(chǔ),對神經(jīng)的再生和HUMSC轉(zhuǎn)化成神經(jīng)樣細(xì)胞有明顯的促進(jìn)作用。

HUMSC具有向神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。孫洪濤等[5]采用原代細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)HUMSC,在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下可實(shí)現(xiàn)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。Mitchell等[6]研究發(fā)現(xiàn),臍帶WJ中的纖維樣細(xì)胞可誘導(dǎo)生成神經(jīng)樣細(xì)胞,并表達(dá)神經(jīng)特異質(zhì)酶(NSE)以及其他神經(jīng)細(xì)胞表面標(biāo)志物。楊立業(yè)等[7]培養(yǎng)HUMSC,發(fā)現(xiàn)其可以表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物,在體外能夠分化為形態(tài)復(fù)雜的神經(jīng)元樣細(xì)胞。

周圍神經(jīng)損傷后局部血運(yùn)豐富,一方面能促進(jìn)氧的代謝,產(chǎn)生足夠的ATP,有利于胞體蛋白質(zhì)的合成,使新生的胞質(zhì)不斷地流動(dòng)到損傷軸突近端的末梢;另一方面,可使神經(jīng)軸突華勒氏變性產(chǎn)物較快消除,有利于神經(jīng)軸突的再生。這也為HUMSC提供了良好的生存環(huán)境,同時(shí)也促進(jìn)HUMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化,達(dá)到修復(fù)神經(jīng)的作用。本研究結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組術(shù)側(cè)置入HUMSC后,腓腸肌肌細(xì)胞直徑逐漸增大,而對照組則逐漸縮小。提示HUMSC在體內(nèi)環(huán)境下分化神經(jīng)樣細(xì)胞且具有神經(jīng)營養(yǎng)作用,有良好的引導(dǎo)神經(jīng)再生的作用。其作用機(jī)制可能有以下幾方面：①HUMSC促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的合成代謝,加速神經(jīng)損傷修復(fù)所需要的蛋白質(zhì)和能量的合成。②HUMSC減輕了神經(jīng)損傷節(jié)段的缺血、水腫和炎癥,緩解局部損傷反應(yīng)。③HUMSC改善神經(jīng)損傷處的微環(huán)境,促進(jìn)雪旺細(xì)胞的再生和功能,增進(jìn)損傷神經(jīng)近端再生軸突和其生長錐的延長。

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[7]楊立業(yè),鄭佳坤,汪朝陽,等.人臍帶來源的基質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,36(1)：13-16.