海人酸致癇大鼠中多藥耐藥相關蛋白1和主穹窿蛋白的表達及作用

王海燕,任艷霞,杜 寧

(1.佳木斯大學第一附屬醫院兒科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學在讀研究生,黑龍江佳木斯 154007)

癲癇是一種神經系統的常見病,但仍有1/3的患者對藥物治療無效而成為難治性癲癇(intractable epilepsy,IE,RE)。然而人們對IE的形成機制尚不清楚,耐藥蛋白可能在其中發揮著重要的作用。多藥耐藥相關蛋白1(M RP1)和主穹窿蛋白(M VP)均是目前研究的熱點,分別由MRP和LRP基因編碼,兩者均位于16號染色體上,MRP定位于16p13.1,LRP定位于16p11.2,相距大約27cM.本課題利用海人酸致癇大鼠模型,觀察海馬中M RP1和MVP的表達,以及兩者之間是否有相關性,以探討其與癲癇耐藥性的關系及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康80只 Wistar大鼠,體重 250～300g,雌雄不限,由佳木斯大學動物實驗中心提供,隨機分為對照組24只、KA組28只、TMP治療組28只,每個小組再分1d、3d、7d 3個時間點。

1.2 主要試劑

海人酸(美國Sigma公司),MRP1抗體、MVP抗體(北京博奧森生物工程有限公司),二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 海人酸癲癇模型建立及大鼠驚厥分級

將大鼠麻醉后固定于立體定位儀上,頭顱正中切開皮膚,暴露前囟。在頭架上,將進樣器針尖抵住前囟位置讀出X、Y、Z的原始值視為原點,參照大鼠腦立體定位圖譜[1]所確定的目標即右側海馬CA3區:X-4.5mm,Y+4.5mm,Z硬膜下4mm,將微量進樣器抽取KA1μ L(將KA用注射用水配制 10mg/5mL,即 2μ g/μ L),調整 XY 坐標 ,顯露硬膜,再調整Z軸使進樣器針頭平穩深入至硬膜下4mm,半分鐘內緩慢注入KA,留針3～5min,再緩慢提起進樣器針尖。對照組以NS代替KA,余同模型組。癲癇發作按Racine[2]分級:Ⅰ級,面部肌肉痙攣表現為咀嚼運動;Ⅱ級,頸部肌肉痙攣表現為點頭運動;Ⅲ級,一側前肢陣攣;Ⅳ級,站立性伴雙前肢陣攣;Ⅴ級,在Ⅳ級基礎上身體向后倒下。

1.4 腦標本制備及免疫組化法檢測M RP1和MVP的表達

用10%水合氯醛(360mg/kg)麻醉后,暴露心臟,迅速經左心室灌注NS及4%多聚甲醛,然后斷頭、取腦、固定、石蠟包埋,4μ m常規切片。做HE及免疫組化染色,操作按試劑盒說明書進行。每張切片對應部位抽取5個視野,計算平均陽性細胞數。

1.5 統計學處理

表1 不同處理組在不同時間海馬M RP1和MVP陽性細胞數(± s)

表1 不同處理組在不同時間海馬M RP1和MVP陽性細胞數(± s)

注:與對照組比較,*P＜0.01;KA組內各個時間點比較**P＜0.05。

時間(d) 平均M RP1陽性細胞數 平均MVP陽性細胞數對照組 KA組 對照組 KA組1 1.70±0.11 7.93±0.66** 1.18±0.03 1.48±0.20**3 0.28±0.02 14.28±0.09* 1.03±0.07 4.94±0.02*7 0 21.71±0.24* 0.93±0.15 11.22±0.78*

2 結果

2.1 大鼠癲癇誘發情況

KA組大鼠注射KA后約半小時即開始出現不同程度的癲癇發作,最初表現為眨眼、動須、動耳、咀嚼、對牙(I級)及節律性點頭、翹尾(Ⅱ級);繼之出現對側前肢陣攣(Ⅲ級);混合出現雙側前肢陣攣(Ⅳ級);四肢抽搐、跌倒和失平衡(V級)。

2.2 各組大鼠M RP1和MVP免疫組化檢測結果

與對照組比較,KA組的MRP1和M VP的表達明顯增高(P＜0.01);KA組的M RP1和MVP隨時間點逐漸升高,7d末達高峰,組內各時間點比較有顯著性差異(P＜0.05);MRP1免疫陽性細胞主要位于海馬CA3區其次為CA1區的血管內皮細胞及部分神經膠質細胞,MVP切片在皮質和海馬中均可見到MVP陽性細胞,主要位于小膠質細胞,在微血管內皮細胞以及血管周圍的星形膠質細胞中也有表達。見表1。

2.3 M RP1和MVP蛋白在KA模型海馬組織中表達關系

在KA模型海馬組織中M RP1和MVP的表達呈正相關(r=0.986,P＜0.01)。

3 討論

最近M RP1和MVP與癲癇耐藥的關系引起了國內外學者的興趣,各家報道不一,目前正處于探索階段。尤其這兩種蛋白在同一組織表達的比較研究還很少見到。本實驗通過研究MRP1和MVP是否在IE模型中出現異常表達,及其表達上的關系,以此探討在IE的發病機制中可能的作用。MRP1屬于 ATP結合盒轉運蛋白超家族,是依賴于ATP的藥物外排泵。同時M RP1是谷胱甘肽-S-共軛物轉運泵,轉運共軛的陰離子,可能包含兩個結合位點,允許與藥物-GSH復合物的直接結合,或者與GSH及底物相繼結合。有人提出,其中一個結合位點與GSH親和力較低;另一個正好相反。所以存在兩種轉運機制:帶陰離子的底物被直接轉運;帶陽離子或中性電荷的分子必須借助于GSH,即共運輸途徑。MRP1不但定位于細胞膜,而且存在于內質網、高爾基濾泡處,提示M RP1還可在細胞內隔離藥物,使藥物不能與靶位點結合,從而間接導致耐藥。M VP是穹窿體的主要組成部分,它能與進入細胞質中的藥物形成囊泡,并通過胞吐作用排出細胞,致靶點藥物有效濃度降低而產生耐藥。其耐藥可能機制有兩種:(1)阻止以細胞核為靶點的藥物進入細胞核,即LRP具有中間塞子的作用,阻止藥物進人細胞核內,或者把已經進人核內的藥物通過轉運載體再重新運到細胞核外。(2)將細胞漿中的藥物轉運至運輸囊泡,從而使藥物呈房室性分布,并通過胞吐機制將其排到細胞外,降低細胞內的藥物濃度,最終產生耐藥。本實驗結果顯示:M RPI對照組大鼠海馬內僅有少量陽性細胞,主要為神經元和神經膠質細胞。KA組大鼠海馬內MRPI陽性細胞顯著增多,MVP在對照組中有弱表達,KA組較對照組明顯增高,且主要表達在小膠質細胞中。MVP在難治性顳葉性癲癇患者腦組織中的血管內皮細胞中廣泛表達,在其病變部位的神經元MVP表達上調。關于MRP1和MVP的表達部位尚無定論,人類和大鼠中表達部位的差異是否有種屬差異引起尚無相關實驗證明。本研究還發現KA組內MRP1和MVP的表達均比對照組明顯增高,長病程組MRP1和M VP表達較短病程組顯著增強,短病程組表達較對照組顯著增強,提示M RP1和M VP在IE早期形成中起作用,在后期并近一步增強;并指出這5種蛋白共同參與了IE的耐藥性[3]。有實驗證明,M RP1和MVP的過度表達與耐藥程度呈正相關,且二者表達有相似之處,并且本實驗統計學上亦證明二者有顯著的相關性;但亦有言論說雖然二者基因定位于16號染色體短臂上,位距27cm,估計二者有某種相關性,但兩者極少同時擴增,故二者在難治性癲癇中的表達是否相關如何相關還需要進一步研究。

[1]包新民,舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京:人民衛生出版社,1991,35

[2]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation[J].Elec troencephalogr Clin Neuro-physiol,1972,32:281-294

[3]肖爭,王學峰,晏勇,等.難治性癲患者腦組織中 5種耐藥基因產物的同步表達及臨床意義[J].中華神經科雜志,2004,37(6):500-503