妊娠期高血壓疾病患者外周血共刺激分子PD-1的表達及臨床意義

呂敬媛,王 丹,趙玉楠

(佳木斯大學附屬第一醫院婦產科,黑龍江佳木斯 154003)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders in pregnancy)是妊娠期特有的疾病。該病嚴重影響母嬰健康,是孕產婦和圍產兒病率和病死率的主要原因。至今病因未明[1]。從免疫學觀點看,妊娠被認為是成功的自然同種異體移植,正常妊娠的維持有賴于胎兒母體間免疫平衡的建立和穩定,如這種平衡被打破,即可導致發生免疫排斥反應,從而引起一系列的血管內皮細胞損傷,進而發生妊娠期高血壓疾病[2～4]。PD-1作為新近發現的 CD28家族重要成員,已被證實通過抑制T細胞的活化和增殖來負調控免疫應答[5],并且在調節免疫耐受以及腫瘤免疫逃逸等中發揮重要作用。因此,本研究用流式細胞術測定妊娠期高血壓疾病患者外周血和雙陽性細胞比例,探討PD-1在妊娠期高血壓疾病發病中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有對象均選取2009—07～2010—06在我院婦產科就診及住院的妊娠婦女。其中妊娠期高血壓疾病患者37例,平均年齡(26.4±4.2)歲,平均孕齡(35.3±4.1)周。包括重度子癇前期患者10例,輕度子癇前期患者12例,妊娠期高血壓患者15例,正常妊娠組15例,平均年齡(25.2±3.7)歲,平均孕齡(36.5±4.6)周。各組病例年齡及孕齡比較均無顯著性差異。診斷及分類標準根據樂杰主編《婦產科學》第7版[1]。孕婦均為初孕婦單胎妊娠,既往無原發性高血壓、糖尿病史,無反復流產史,心肝肺腎功能正常,未經生殖技術幫助,無免疫性疾病,未經免疫藥物治療。

1.2 實驗試劑

流式細胞檢測所用單抗及同型對照抗體:PE-cy5標記人CD4單抗,FITC標記人PD-l單抗;PE-cy5標記人和FITC標記人IgGI同型對照抗體,均購自EB公司。

1.3 方法

1.3.1 血標本采集及外周血PBMC分離

分別抽取各組研究對象前臂肘靜脈血3mL(妊娠期高血壓疾病患者均于住院治療前抽血),采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。將制成的單個核細胞懸液在12h內送流式檢驗和雙陽性細胞百分比。

取單個核細胞懸液,將其分成4份,每份150μ L,加流式單抗或同型對照抗體:(l)空白管:加20μ L PBS;(2)同型對照1:加10μ L PE-Cy5標記人CD4單抗和10μ L FITC 標記人同型對照抗體;(3)同型對照2:加 10μ L PE-Cy5標記人同型對照抗體和 10μ L FITC標記人 PD-1單抗;(4)測定管:加PE-Cy5標記人CD4單抗以及FITC標記人PD-1單抗。4℃孵育30min,加1mL PBS1000r/min離心8min洗滌,共洗滌二次;加200μ L PBS重懸細胞,上機檢測。以各自的同型對照管參數設門,將測定管參數減去同型對照背景,則為測定管參數值。以相關配套軟件計算和+雙陽性細胞比例,結果以百分比(%)表示。

1.4 統計學處理

實驗結果以均數±標準差(±s)表示,以SPSS13.0軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA),各組兩兩比較用q檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

表1 各組PBMC中CD4+和CD4+PD-1+細胞比例(±s)

表1 各組PBMC中CD4+和CD4+PD-1+細胞比例(±s)

★與正常妊娠組相比(P＜0.05),▲ 與妊娠期高血壓組相比(P＜0.05),● 與輕度子癇前期組相比(P＜0.05)。

組 別 n CD+4(%) CD+4PD-1+(%)正常妊娠組 15 21.87±1.23 3.89±0.73妊娠期高血壓組 15 21.90±1.20 9.50±1.02★輕度子癇前期組 12 22.80±0.91★▲ 17.90±2.13★▲重度子癇前期組 10 25.27±0.99★▲● 25.60±3.02★▲●

3 討論

從現代免疫學觀點看,妊娠是母胎免疫系統相互作用的過程,胎兒攜帶有父源性抗原,對母體的免疫系統來說是一種半同種移植物,正常妊娠是母體免疫系統對胎兒的免疫耐受過程。一旦母胎間免疫耐受平衡失調,便可導致免疫排斥反應,從而發生妊娠失敗及某些妊娠并發癥,如妊娠期高血壓疾病、習慣性流產等。目前大量的研究表明妊娠期高血壓疾病與免疫系統存在密切的關系。在妊娠期高血壓疾病形成過程中,免疫系統和免疫細胞起到了重要作用。在妊娠期高血壓疾病形成和演變中不同的T淋巴細胞亞群起不同的作用,其中對其發生起優勢作用的T細胞類型是CD4陽性T輔助細胞(Th)。PD-1是表達在激活狀態的 T、B細胞上的一種協同性信號調節分子,屬于免疫球蛋白(Ig)超家族成員,與以前發現的CTLA-4有相似性,屬于負性調控的協同信號分子,表現對激活后T、B細胞炎癥程度的下調和炎癥范圍的限制[6]。與CT LA-4表達時限的區別是PD-1表達的時限相對較晚,持續時間長,現有研究發現PD-1多表達在慢性感染性疾病或者自身免疫性疾病的炎性細胞表面,其配體主要有PD-Ll和PD-L2,PD-1與其配體結合后介導對免疫細胞周圍性耐受,能下調其炎癥反應程度。缺乏PD-1受體的T淋巴細胞(無論是還是細胞)的增殖能力和分泌細胞因子功能均顯著增強,并且基本不表現凋亡,不能介導周圍性耐受[7]。PD-1在妊娠期高血壓疾病病人外周血PBMC中的表達情況,目前尚無明確結果。本研究用流式細胞方法測定了妊娠期高血壓疾病患者外周血PBMC中CD4和PD-1的表達水平,并與正常妊娠組進行了對比分析。結果發現,妊娠期高血壓疾病患者細胞比例增多,重度子癇前期組患者其比例增加更明顯,與文獻報道結果一致。與其他報道不同的是,本研究檢測了不同類型的妊娠期高血壓疾病患者外周血細胞上PD-l表達的水平,即 PBMC中比例。結果發現,與正常妊娠組比較,在妊娠期高血壓疾病各組雙陽性細胞比例均較對照組增高,由文獻可知PD-l是在T細胞激活以后表達的負性調控表面分子,故結合本研究結果推測細胞高表達PD-1其作用可能是反饋性抑制細胞的過度激活。這對深入研究妊娠期高血壓疾病的機制展現了一個窗口,對臨床治療提供了一個潛在的靶標。但是PD-1對妊娠期高血壓疾病影響的直接證據還有賴于進一步的研究。

[1]樂杰主編.婦產科學[M].第7版,北京:人民衛生出版社,2008,92-94

[2]Redmancw G,Sargenti L.Latest advances in understanding PreeclamPsia[J].Science,2005,308(5728):1592-1594

[3]Sibai B,Dekker G.KuPherminc M.Preeclampsia[J].Lancet,2005,365(9461):785-799

[4]Merviel P,Carbillon L,Challier JC,et al.Pathophysiology of Preeclam Psia:1inks with Implantation disorders[J].European J Obstet Gynecol Reprod Biol,2004,115(2):134-147

[5]Greenwald R J,Freeman G J,Sharpe A H.The B7 family revisited[J].Annu Rev Immunol,2005,23:515-548

[6]Steppich BA,Moog P,Matissek C,et al.Cytokine Profiles and T cell function in acute coronary syndromes[J].Atherosclerosis,2007,190(2):443-451

[7]D Souza M,Fontenot AP,Mack DG,et al.Programmed death 1 expression on HIV-specific CD4+T cells is driven by viral replication and associated with T cell dysfunction[J].J Immunol,2007,179(3):1979-1987