何首烏對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的作用

朱秋雙,任春清,包利澤,趙錦程,劉 蕾,白 雪,楊 玉

(1.佳木斯大學基礎醫學院,黑龍江佳木斯 154007;2.佳木斯市中心醫院,黑龍江 佳木斯154002;3.佳木斯中小學保健所,黑龍江 佳木斯154002)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又稱原發性癡呆癥是一種與年齡高度相關的、以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病。該病以潛隱性起病、癡呆緩慢進行性加重為特征,臨床表現為記憶力、判斷力、抽象思維等一般智力的喪失,神經病理改變可見神經元變性、丟失引起的腦萎縮,細胞外的老年斑(senile plaque,SP)等。本病要經歷兩種死亡,首先是精神死亡,然后是肉體死亡,給患者本人、家庭和社會帶來相當沉重的負擔。何首烏為蓼科植物的塊根,具有補肝益腎,益髓延年之功,為傳統的益智藥。有報道何首烏對小鼠學習記憶功能有促進作用。本研究旨在進一步觀察何首烏對Aβ1-40致AD小鼠的學習記憶能力的改善作用并探討其機理。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

Aβ1-40(美國Sigma公司),1:1何首烏硫浸膏(黑龍江省藥材公司提供并由佳木斯大學藥理教研室加工)。

1.2 實驗儀器

Y-迷宮:北京微信斯達科技發展有限責任公司生產。

1.3 動物

SD雄性大鼠,體重約200～220g,佳木斯大學實驗動物中心提供,動物合格證黑動字第99101001號。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物篩選與分組

大鼠適應環境1d后,先將大鼠放入Y型電迷宮中,適應5min,使其對3臂均探索進入,然后從I臂開始隨機次序變換測試,給電壓30～70V,電流0.5～0.7mA,延遲時間 5s。電擊后大鼠逃避至安全區為正確反應,否則為錯誤反應。每測1次休息30s,測10次休息5min。大鼠學習記憶成績以連續10次測試中有9次(9/10)正確反應時,所需電擊數表示。測試在上午進行,連續30次未跑正確者被淘汰。再將動物隨機分成3組:對照組,阿爾茨海默病模型組及何首烏硫浸膏治療組,每組10只。

1.4.2 Aβ孵育

用無菌生理鹽水將Aβ1-40稀釋成10μ g/μ L,37℃下孵育1周,使其變為聚集狀的Aβ1-40。

1.4.3 動物模型的制作[1]

大鼠腹腔注射濃度100g/L水合氯醛(0.35g/kg)麻醉動物,然后固定于腦立體定位儀上,分開筋膜于前囟后3.0mm,中線右側2.0mm處鉆開顱骨,切開硬腦膜后,自腦表面緩慢垂自進針2.9mm(控制注射速度 0.2μ L/min),阿爾茨海默病模型組注射聚集狀 Aβ1-40 1μ L,留針 5min,然后緩慢撤針。對照組只注射等量生理鹽水,余操作同上。

1.4.4 分組給藥

大鼠醒后,何首烏組即何首烏硫浸膏25g/(kg?d)灌胃,每日分兩次(上午9時和下午4時)。其余組均灌等量的生理鹽水。

1.4.5 大鼠分辨學習能力的檢測

各組在同時間點(術后 5、10、15、20d)按前述說明進行Y迷宮測試,規定大鼠受電擊后從起步區直接逃至安全區為“正確反應”,以達到連續9次電擊為正確反應,所需的電擊次數表示其學習獲得能力。若次數超過30次則不再測試,并以30次為最大值計數。

1.4.6 記憶保持的觀察

用Y-迷宮檢測上述小鼠在達到分辨學習的學會標準后24h記憶的保持,連續檢測10次記錄,其中正確反應次數,以記憶保持的百分數表示。

1.4.7 形態學觀察[2]

在行為學檢測結束后,將大鼠拉斷頸椎處死,迅速取出全腦,10%福爾馬林溶液中固定72h,常規包埋石蠟切片,冠狀連續切片(厚度50μ m),海馬組織每 5張取1張,一個標本取3張,HE染色×540光學顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區細胞形態。細胞計量采用每 200μ m×400μ m長度下正常細胞數,每張切片觀察一個計量單位,取平均值為該標本的細胞記數。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠學習記憶能力測試結果

結果表明術前各組學習能力基本一致。原發性癡呆癥模型組大鼠主動逃避電擊次數明顯多于兩個對照組,且隨時間推移,所需電擊次數反而增加,說明該組大鼠學習記憶獲得能力明顯下降。治療組在術后5d,10d與模型組無明顯差異(P＞0.05),但在15d后與模型組比較(△P＜0.05),且至術后20d時學習記憶獲得能力有明顯提高,與模型組比較(＊P＜0.01),與對照組比較(▲P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠迷宮學習能力的結果(n=10,± s,次)

表1 各組大鼠迷宮學習能力的結果(n=10,± s,次)

注:與對照組比較▲P ＜0.05,;與模型組比較△P＜0.05,＊P＜0.01。

組別 術前 術后5d 術后10d 術后15d 術后20d原發性癡呆癥模型組 13.1±2.1 25.4±5.6 26.7±6.1 26.6±6.1 27.5±5.3何首烏硫浸膏治療組 14.6±2.3 24.4±6.2 20.9±5.4 18.4±4.6△ 15.3±2.8＊▲_正常對照組___________________________________________________________________________________________________________________________________14.3±2.8_13.2±2.9_11.3±2.0_13.8±1.8_10.4±1.3

2.2 記憶保持的觀察和海馬細胞數

結果表明與正常對照組比較,原發性癡呆癥模型組和何首烏硫浸膏治療組記憶能力均降低,海馬細胞數均減少,差異有統計學意義。與原發性癡呆癥模型組比較,何首烏硫浸膏治療組記憶能力提高,海馬細胞數提高,差異有統計學意義(△P ＜0.01),見表2。

表2 對大鼠學習與記憶能力及海馬正常細胞數的影響(n=10,± s)

表2 對大鼠學習與記憶能力及海馬正常細胞數的影響(n=10,± s)

注:與對照組比較＊P＜0.01,▲P＜0.05;與原發性癡呆癥模型組比較△P＜0.01。

組別 記憶能力(正確%) 海馬細胞數原發性癡呆癥模型組 47.49±2.99＊ 74.49±2.62＊何首烏硫浸膏治療組 65.56±3.33▲△ 83.53±3.91＊△正常對照組 69.22±3.98 98.12±2.69

3 討論

原發性癡呆是指在老年人衰老退化基礎上發生的癡呆,如早老性癡呆、老年性癡呆等。原發性癡呆的病因及發病機制目前尚不十分清楚。有研究認為是39-43個氨基酸組成的Aβ沉積為特征的進行性中樞神經系統變性疾病,還證明Aβ的營養作用和毒性作用取決于它從可溶性表明變為不可溶性的聚集狀態。目前認為神經毒性物質Aβ在腦中廣泛沉積在原發性癡呆發病中起中心作用,能引發神經元退化和凋亡等諸多病理過程,最后引起癡呆。由于海馬與學習記憶,特別是近記憶功能密切相關,是原發性癡呆中最易受累的腦區之一[3]。因此本研究利用立體定向技術將聚集態Aβ注入大鼠右側海馬,用Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間學習記憶能力,觀察到大鼠的學習記憶能力明顯下降,海馬細胞數減少,阿爾茨海默病模型制作成功。何首烏具有補肝腎,益精血,烏須發,強筋骨,延緩衰老功效。大鼠何首烏硫浸膏25g/(kg?d)灌胃,觀察到何首烏對阿爾茨海默病模型大鼠的分辨學習及記憶保持能力有極大提高,對海馬細胞數有保護作用。因此通過本實驗可得出結論何首烏對大鼠的學習記憶有保護作用,其具體機制可能與其抑制海馬細胞凋亡有關。

[1]鄢嘉,曾超,吳云霞,等.續斷總皂苷對阿爾茨海默病小鼠_學習記憶能力的改善作用[J].武漢大學學報,2010,31(3):324-325

[2]朱秋雙,劉明遠,劉蕾,等.青風藤對嗎啡成癮小鼠學習與記憶能力的影響[J].黑龍江醫藥科學,2009,32(4):9-10

[3]Giovannel L,Gasamenti F,Scall C,et al.Differential effect of amyloid peptide Aβ1-40 injection into the rat nucleus basalis[J].Neuroscience,1995,66:781-782