蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣與S100b基因表達的相關性

谷志龍,楊福義,楊衛(wèi)東,張 瑤

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,黑龍江佳木斯 154003)

血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血的嚴重并發(fā)癥之一,能造成血腦屏障的變化,導致神經(jīng)細胞的水腫、變性壞死等病理變化[1],嚴重影響患者的預后,乃至死亡。S100b含量與血管痙攣的發(fā)生密切相關。但以往的研究僅停留在檢測血漿及腦脊液中S100b濃度的水平,本實驗采用RT-PCR法對S100b基因進行檢測,并利用Western-blot技術對大鼠基底動脈組織中的S100b蛋白進行檢測,進一步的探討S100b基因表達水平和血管痙攣的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

4%多聚甲醛、10%水合三氯乙醛、RT-PCR試劑盒、DEPC 、Trizol液、引物(大連寶生物)和DNA marker。兔抗大鼠S100b抗體(SANTA CRUZ),辣根酶標記羊抗兔二抗(中杉金橋),內(nèi)參β-actin,蛋白質(zhì)marker,PVDF膜(碧云天)。大鼠S100b基因片段擴增的引物序列,上游5'-GCCCTCATTGATGTCTTCC-3';下游 3'-TCCTTTAGT TTCTCGTCCTTC-5',擴增引物長度為 130bp;βactin基因片段擴增的引物序列,上游 5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3';下游 3'-GCAACTGTAGGCATTTCTGG-5',擴增引物長度為 652bp。電泳儀、PCR儀、DU-800蛋白核酸分析儀、PAGE凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀、聯(lián)科發(fā)光試劑盒等。

1.2 方法

①將Wistar大鼠腹腔麻醉,備皮消毒。斷尾取血 0.3mL,經(jīng)環(huán)枕膜垂直進針2.5mm后緩慢注入枕大池,注血速度控制在0.lmL/min以內(nèi),縫合切口,消毒。假手術組,用等量的生理鹽水做相同處理。術后大鼠盡量保持頭低俯臥位為0.lmL/min,縫合切口,消毒。

②3d后斷髓處死大鼠,通過后頸部取出含有腦干的基底動脈,一部分放置在液氮中保存,用于基因和蛋白的檢測,另一部分放置在多聚甲醛中固定1d。經(jīng)過固定、浸潤、脫水、透明后包埋,每組各標本均切4張,厚度為 7μ m,進行 HE染色。

③基底動脈組織一部分用于組織勻漿的制備;一部分立即放入液氮速凍后,在-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ』讋用}組織100mg于無菌勻漿器中,加冰生理鹽水1mL,置于冰上勻漿。離心后,取上清液制成1%的組織勻漿。S100b基因的表達:RT-PCR法。大鼠基底動脈組織RNA,測280nm/260nm OD值后即進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,TB染色,凝膠成像儀成像后用Tannon Gis軟件分析。基底動脈組織中 S100b蛋白的表達:Western Blot法檢測檢。提取大鼠基底動脈組織總蛋白,檢測蛋白含量:采用BCA法,通過PAGE凝膠電泳分離蛋白,各孔上樣體積20μ L,電泳約1.5h后取膠,根據(jù)M arker,切取10KD大小蛋白位置的膠,半干法在轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)膜,100mA流,60min。轉(zhuǎn)膜后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1.5h,經(jīng)過一抗孵育,4℃冰箱過夜,取出后用TBST洗滌3次,各 10min,二抗室溫孵育1.5h后,TBST洗滌3次,各10min,ECL發(fā)光液顯色,曝光,通過Tannon Gis軟件分析,測光密度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)HE染色鏡下觀察

大鼠基底動脈經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn):正常對照組,生理鹽水組可見動脈內(nèi)膜完整,內(nèi)皮細胞排列緊密;手術組出現(xiàn)內(nèi)皮細胞褶皺、變性,平滑肌細胞肥大,可見炎性細胞浸潤,且管腔直徑明顯小于正常對照組和生理鹽水組,見圖1。

2.2 各組大鼠基底動脈中S100B基因及蛋白表達情況

S100b mRNA及蛋白在對照組和假手術組中均有微量表達,且差異不顯著(P＞0.05);與假手術組相比,手術組表達明顯(P＜0.01)。

圖1 Wistar大鼠基底動脈觀察(HE×200)

表1 S100b基因及蛋白在基底動脈中的表達分析結(jié)果(± s)

表1 S100b基因及蛋白在基底動脈中的表達分析結(jié)果(± s)

注※與對照組比較,P＞0.05;# 與假手術組比較,P＜0.01。

_組別 n S100b/β-actin(mRNA) S100b/β-actin(Protein)對照組 10 0.037±0.043 0.2092±0.0626 0.0243±0.0530 0.1792±0.0734假手術組 10 0.051±0.0471※ 0.3602±0.0822 0.0683±0.06811# 0.2461±0.0836_手術組 8 0.303±0.0812※ 0.8709±0.0751_________________0.5291±0.094_______________________________62#_0.8479±0.0829

圖2 S100b mRNA RT-PCR后電泳圖

3 討論

S100b蛋白是Moore等[2]人在1965年首先在牛的腦組織發(fā)現(xiàn)的,此種蛋白能完全溶解在中性飽和硫酸銨中而因此得名。高濃度的S100b具有神經(jīng)毒性,濃度大小與腦血管疾病,顱腦外傷及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。我們的實驗發(fā)現(xiàn)S100b基因表達與蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣密切相關。

目前蛛網(wǎng)膜下腔出血動物模型的制備主要有:穿刺法[3]是阻斷頸總動脈后通過頸總動脈進入頸內(nèi)動脈并刺破分叉處制作而成,手術成熟,簡單,無需開顱,但手術過程中易造成短暫性腦缺血,誘發(fā)腦梗塞,術后動物死亡率高;血管撕裂法,穿刺法以及注血法。血管撕裂法主要是撕裂大腦中主要大動脈來模擬蛛網(wǎng)膜下腔出血,該方法的出血時間,出血速度,出血量不易被控制,且模型制備過程中破損了蛛網(wǎng)膜的完整性,導致硬膜下血腫;而注血法[4]無需破壞動脈壁,通過腦池如枕大池,視交叉池,將血液直接注入蛛網(wǎng)膜下腔,該方法具有操作簡單、直接、重復性高,出血量可控制的優(yōu)點。因此本實驗利用枕大池注血法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,通過術后3d對大鼠基底動脈進行HE染色,鏡下發(fā)現(xiàn)血管管腔狹窄、內(nèi)皮細胞變性、平滑肌細胞肥大,同時伴有外膜炎性細胞浸潤的病理變化。S100b是一種酸性鈣結(jié)合蛋白,廣泛存在于哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的星型角質(zhì)細胞中,正常體內(nèi)含微量S100b蛋白,通過和鈣離子結(jié)合,激活腦果糖1,6-2磷酸醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶,進而調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的能量代謝,對神經(jīng)的生長和修復起到促進作用[5];高濃度的S100b在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有神經(jīng)毒性,通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)的一氧化氮介導的死亡途徑引起神經(jīng)元的死亡。S100b通過促進細胞內(nèi)PI(磷脂酰肌醇)水解,其分解產(chǎn)物IP3(三磷酸肌醇)作用于肌漿網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣通道,使鈣通道開放,釋放Ca2+。Ca2+一方面和S100b結(jié)合引起其構(gòu)象改變進而和細胞膜結(jié)合,使平滑肌纖維染色增強;另一方面和鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合,通過磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶(M LCK)使其失去對肌動蛋白ATP酶的抑制,促使αaction肌絲滑行,引起腦血管平滑肌收縮,痙攣[6]。綜上所述,蛛網(wǎng)膜下腔出血后S100b的表達上調(diào),高濃度的S100b蛋白通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi)的一氧化氮介導的死亡途徑引起神經(jīng)元的死亡,腦血管平滑肌痙攣。但是有關于蛛網(wǎng)膜下腔出血后通過何種機制引起腦血管痙攣還有待于進一步的研究。

圖3 S100b蛋白印跡圖

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