蛛網膜下腔出血后血管痙攣與S100b基因表達的相關性

谷志龍,楊福義,楊衛東,張 瑤

(佳木斯大學附屬第一醫院神經外科,黑龍江佳木斯 154003)

血管痙攣是蛛網膜下腔出血的嚴重并發癥之一,能造成血腦屏障的變化,導致神經細胞的水腫、變性壞死等病理變化[1],嚴重影響患者的預后,乃至死亡。S100b含量與血管痙攣的發生密切相關。但以往的研究僅停留在檢測血漿及腦脊液中S100b濃度的水平,本實驗采用RT-PCR法對S100b基因進行檢測,并利用Western-blot技術對大鼠基底動脈組織中的S100b蛋白進行檢測,進一步的探討S100b基因表達水平和血管痙攣的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

4%多聚甲醛、10%水合三氯乙醛、RT-PCR試劑盒、DEPC 、Trizol液、引物(大連寶生物)和DNA marker。兔抗大鼠S100b抗體(SANTA CRUZ),辣根酶標記羊抗兔二抗(中杉金橋),內參β-actin,蛋白質marker,PVDF膜(碧云天)。大鼠S100b基因片段擴增的引物序列,上游5'-GCCCTCATTGATGTCTTCC-3';下游 3'-TCCTTTAGT TTCTCGTCCTTC-5',擴增引物長度為 130bp;βactin基因片段擴增的引物序列,上游 5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3';下游 3'-GCAACTGTAGGCATTTCTGG-5',擴增引物長度為 652bp。電泳儀、PCR儀、DU-800蛋白核酸分析儀、PAGE凝膠電泳儀、凝膠成像系統、轉膜儀、聯科發光試劑盒等。

1.2 方法

①將Wistar大鼠腹腔麻醉,備皮消毒。斷尾取血 0.3mL,經環枕膜垂直進針2.5mm后緩慢注入枕大池,注血速度控制在0.lmL/min以內,縫合切口,消毒。假手術組,用等量的生理鹽水做相同處理。術后大鼠盡量保持頭低俯臥位為0.lmL/min,縫合切口,消毒。

②3d后斷髓處死大鼠,通過后頸部取出含有腦干的基底動脈,一部分放置在液氮中保存,用于基因和蛋白的檢測,另一部分放置在多聚甲醛中固定1d。經過固定、浸潤、脫水、透明后包埋,每組各標本均切4張,厚度為 7μ m,進行 HE染色。

③基底動脈組織一部分用于組織勻漿的制備;一部分立即放入液氮速凍后,在-80℃保存備用。取基底動脈組織100mg于無菌勻漿器中,加冰生理鹽水1mL,置于冰上勻漿。離心后,取上清液制成1%的組織勻漿。S100b基因的表達:RT-PCR法。大鼠基底動脈組織RNA,測280nm/260nm OD值后即進行逆轉錄合成cDNA。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離,TB染色,凝膠成像儀成像后用Tannon Gis軟件分析。基底動脈組織中 S100b蛋白的表達:Western Blot法檢測檢。提取大鼠基底動脈組織總蛋白,檢測蛋白含量:采用BCA法,通過PAGE凝膠電泳分離蛋白,各孔上樣體積20μ L,電泳約1.5h后取膠,根據M arker,切取10KD大小蛋白位置的膠,半干法在轉膜儀上轉膜,100mA流,60min。轉膜后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1.5h,經過一抗孵育,4℃冰箱過夜,取出后用TBST洗滌3次,各 10min,二抗室溫孵育1.5h后,TBST洗滌3次,各10min,ECL發光液顯色,曝光,通過Tannon Gis軟件分析,測光密度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 常規HE染色鏡下觀察

大鼠基底動脈經HE染色后發現:正常對照組,生理鹽水組可見動脈內膜完整,內皮細胞排列緊密;手術組出現內皮細胞褶皺、變性,平滑肌細胞肥大,可見炎性細胞浸潤,且管腔直徑明顯小于正常對照組和生理鹽水組,見圖1。

2.2 各組大鼠基底動脈中S100B基因及蛋白表達情況

S100b mRNA及蛋白在對照組和假手術組中均有微量表達,且差異不顯著(P＞0.05);與假手術組相比,手術組表達明顯(P＜0.01)。

圖1 Wistar大鼠基底動脈觀察(HE×200)

表1 S100b基因及蛋白在基底動脈中的表達分析結果(± s)

表1 S100b基因及蛋白在基底動脈中的表達分析結果(± s)

注※與對照組比較,P＞0.05;# 與假手術組比較,P＜0.01。

_組別 n S100b/β-actin(mRNA) S100b/β-actin(Protein)對照組 10 0.037±0.043 0.2092±0.0626 0.0243±0.0530 0.1792±0.0734假手術組 10 0.051±0.0471※ 0.3602±0.0822 0.0683±0.06811# 0.2461±0.0836_手術組 8 0.303±0.0812※ 0.8709±0.0751_________________0.5291±0.094_______________________________62#_0.8479±0.0829

圖2 S100b mRNA RT-PCR后電泳圖

3 討論

S100b蛋白是Moore等[2]人在1965年首先在牛的腦組織發現的,此種蛋白能完全溶解在中性飽和硫酸銨中而因此得名。高濃度的S100b具有神經毒性,濃度大小與腦血管疾病,顱腦外傷及其他神經系統疾病密切相關。我們的實驗發現S100b基因表達與蛛網膜下腔出血后的腦血管痙攣密切相關。

目前蛛網膜下腔出血動物模型的制備主要有:穿刺法[3]是阻斷頸總動脈后通過頸總動脈進入頸內動脈并刺破分叉處制作而成,手術成熟,簡單,無需開顱,但手術過程中易造成短暫性腦缺血,誘發腦梗塞,術后動物死亡率高;血管撕裂法,穿刺法以及注血法。血管撕裂法主要是撕裂大腦中主要大動脈來模擬蛛網膜下腔出血,該方法的出血時間,出血速度,出血量不易被控制,且模型制備過程中破損了蛛網膜的完整性,導致硬膜下血腫;而注血法[4]無需破壞動脈壁,通過腦池如枕大池,視交叉池,將血液直接注入蛛網膜下腔,該方法具有操作簡單、直接、重復性高,出血量可控制的優點。因此本實驗利用枕大池注血法建立蛛網膜下腔出血模型,通過術后3d對大鼠基底動脈進行HE染色,鏡下發現血管管腔狹窄、內皮細胞變性、平滑肌細胞肥大,同時伴有外膜炎性細胞浸潤的病理變化。S100b是一種酸性鈣結合蛋白,廣泛存在于哺乳動物的中樞神經系統內的星型角質細胞中,正常體內含微量S100b蛋白,通過和鈣離子結合,激活腦果糖1,6-2磷酸醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶,進而調節神經細胞的能量代謝,對神經的生長和修復起到促進作用[5];高濃度的S100b在中樞神經系統內具有神經毒性,通過激活神經膠質細胞內的一氧化氮介導的死亡途徑引起神經元的死亡。S100b通過促進細胞內PI(磷脂酰肌醇)水解,其分解產物IP3(三磷酸肌醇)作用于肌漿網和滑面內質網上的鈣通道,使鈣通道開放,釋放Ca2+。Ca2+一方面和S100b結合引起其構象改變進而和細胞膜結合,使平滑肌纖維染色增強;另一方面和鈣調蛋白(CaM)結合,通過磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶(M LCK)使其失去對肌動蛋白ATP酶的抑制,促使αaction肌絲滑行,引起腦血管平滑肌收縮,痙攣[6]。綜上所述,蛛網膜下腔出血后S100b的表達上調,高濃度的S100b蛋白通過激活神經膠質細胞內的一氧化氮介導的死亡途徑引起神經元的死亡,腦血管平滑肌痙攣。但是有關于蛛網膜下腔出血后通過何種機制引起腦血管痙攣還有待于進一步的研究。

圖3 S100b蛋白印跡圖

[1]D ietrich H H,Dacey R C Jr.Molecu lar keys to the problems of cerebral vasospasm[J].Neurosurgery,2000,46(3):517-530

[2]M oore BM.A solube protein characteristic of the nervous system[J].Biochem Biophy s Res Commun,1965,19(6):739-744

[3]Weir B.VasosPasm in response to repeated subarachnoid hemorrhage in the monkey[J].J NeurosUrg,1970,33:395

[4]Piepgras A.Characterization of an anterior circulation rat subaraehnoid hemorrhage model[J].Stroke,1995,26:395

[5]Donato R.Intracellular and extracellular roles of S100 protein[J].Microsc Res Tech,2003,60(6):540-551

[6]Lefranc F,Golzarian J,Chevalie C,et al.Expression of members of the calcium-binding S-100 protein family in a rat model of cerebral basilar artery vasospasm[J].J Neurosurg,2002,97(2):408-415