5-Aza-2dc通過表觀修飾對Naive T細胞誘導(dǎo)的研究

何 敏,盧思廣

(1.徐州醫(yī)學(xué)院,江蘇徐州 221002;2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港第一人民醫(yī)院兒科,江蘇連云港 222000)

30多年前,研究者發(fā)現(xiàn)了大量具有解除特異抗原的免疫應(yīng)答的淋巴細胞。在1975年,這些細胞被命名為抑制細胞,即目前的 T reg細胞,它可抑制器官移植的排斥反應(yīng)[1]。Treg細胞表面高表達CD25,而胞內(nèi)Foxp3基因是其一個相對特異標志和功能分子,高表達Foxp3基因的Treg細胞對于維持免疫系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和預(yù)防自身免疫疾病有極其重要的作用[2]。而Foxp3基因的穩(wěn)定表達可通過表觀修飾方式調(diào)節(jié),如組蛋白及DNA修飾。在Treg細胞中,foxp3啟動子區(qū)的CPG模體幾乎完全去甲基化,顯示穩(wěn)定的Foxp3的表達,而CD4+CD25-T細胞正好相反[3,4]。目前,5-雜氮-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2dc)是研究最多的去甲基化藥物,它能夠逆轉(zhuǎn)基因的甲基化狀態(tài),從而恢復(fù)基因的表達水平。近年來,國內(nèi)外對組蛋白去乙酰化抑制酶試劑(如TSA)通過表觀修飾研究較多,但使用DNA甲基化酶抑制劑5-Aza-2dc誘導(dǎo)Treg細胞研究較少,特別是這種藥物對Treg細胞表型維持的研究。本研究中,用5-Aza-2dc試劑使DNA去甲基化,促進特異基因Foxp3的表達,并可使CD4+CD25-T細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細胞,從而為穩(wěn)定與預(yù)防自身免疫疾病提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

PHA(美國Sigma);人Treg分選試劑盒和MACS分選器(德國Miltenyi);MTT試劑(美國Sigma);5-Aza-2d(美國Sigma);人淋巴細胞分離液(加拿大Cedarlane);酶標儀(美國BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 PHA最佳濃度的摸索

用含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液調(diào)整PBMC密度至 1×106/mL,并加入不同終濃度PHA(0μ g/mL、μ g/mL、7.5μ g/mL 、10μ g/mL 、12.5μ g/mL),每個濃度設(shè)置 5個復(fù)孔,置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 68h,然后加入 MT T繼續(xù)培養(yǎng) 0h、2h、4h、6h,在倒置顯微鏡下觀察細胞的顯色,分別上酶標儀波長450nm,參考波長650nm,檢測各孔細胞光密度值(OD值),確定最佳的檢測時間和刺激濃度。

1.2.2 CD4+CD25+T細胞的分離及純度鑒定

采集100mL新鮮外周血(自愿獻血的健康人)使用Fillcon密度梯度離心法分離人 PBMC,參照美天旎 CD4+CD25+T reg細胞的免疫磁珠分選試劑盒說明書,獲得陰選CD4+CD25-T細胞,陽選CD4+CD25+T reg細胞(即 nT-reg)。分別取少量分選所得細胞,加入抗CD4/抗CD25熒光抗體,避光孵育15min,PBS緩沖液洗滌一次,加PBS重懸,然后上流式細胞儀(FCM)檢測純度。

1.2.3 分選細胞活性及計數(shù)檢測

利用臺盼藍染色法評價淋巴細胞活性,取0.1mL細胞懸液,加等量的0.4%臺盼藍溶液,充分混勻,染色2min。取上述細胞懸液少許滴在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹足曹處流出懸液,至蓋玻片被液體充滿為止。置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。計數(shù)其中藍染的細胞。結(jié)果顯示正常細胞不著色,死細胞被染成藍色。細胞活力及密度按下列公式計算:細胞活力(%)=(總細胞數(shù)-著色細胞數(shù))÷總細胞數(shù)×100%;細胞密度=(4個大格細胞總數(shù)/4)×104/mL

1.2.4 制備抗原提呈細胞

使用含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液調(diào)整部分CD4+CD25-T細胞密度至 1×107/mL,加入終濃度25μ g/mL的絲裂霉素 C,置 37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)30min,使用RPMI 1640清洗 3次,并調(diào)整細胞密度至1×106/mL備用。

1.2.5 數(shù)據(jù)整理

使用SPSS v13.0統(tǒng)計軟件進行分析,各組計量資料以(± s)表示,各組進行比較前先進行正態(tài)性及方差齊性檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 免疫磁珠分選的結(jié)果

分選前PBM C活力為(95.63±1.80)%,分選后 CD4+CD25-T細胞和CD4+CD25+T細胞活力分別為(95.70±1.50)%和(93.60±2.16)%,分選前后細胞活力比較無明顯差異(P＞0.05)。

2.2 不同濃度5-Aza-2dc對Naive T細胞的誘導(dǎo)

實驗中我們把三種不同濃度5-Aza-2dc處理后,Naive T細胞受到不同程度的誘導(dǎo),且濃度在 100μ g時,誘導(dǎo)率最高。見表1。

2.3 在不同處理時間下,對Naive T細胞的誘導(dǎo)

根據(jù)上述結(jié)果,在5-Aza-2dc濃度為100ng/mL時,使用不同時間進行誘導(dǎo),用流式細胞儀檢測膜標志CD25的表達。結(jié)果顯示,藥物處理后72h,Treg細胞比例最大。見表2。

表1 不同濃度5-Aza-2dc對Naive T細胞的影響(n=5)

表2 5-Aza-2dc不同處理時間下對細胞誘導(dǎo)的影響(n=5)

3 討論

Treg細胞在體內(nèi)僅占外周CD4+T細胞的5%～10%,絕對數(shù)量極少,在抗原的刺激下,自身又很難擴增和增殖,因此,本實驗選擇Naive T細胞作為研究對象,此類細胞并非終末期細胞,通過不同藥物誘導(dǎo)分化這類細胞成目的細胞。5-Aza-2dc作為一種嘧啶核苷類似物,在DNA復(fù)制過程中與甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)結(jié)合形成一種共價復(fù)合物,抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性,從而達到去甲基化,使多種因甲基化而失活的基因重新表達,恢復(fù)基因的功能,促使細胞的轉(zhuǎn)化。在本研究中,該藥物可以促使Naive T細胞內(nèi)的Foxp3基因重新表達,而Foxp3基因是T reg細胞的相對特異的標志和功能分子,故可誘導(dǎo)Naive T細胞轉(zhuǎn)化為Treg細胞,研究結(jié)果顯示,在培養(yǎng)第24小時后,T reg細胞數(shù)明顯上升,72h膜標志CD25含量最高,而接下來的繼續(xù)培養(yǎng)中或撤離藥物,隨著時間延長,Treg細胞的比例逐漸減少,因此,5-Aza-2dc只能短暫地維持細胞的表型穩(wěn)定。如能成功實現(xiàn)對Treg細胞表型的長期穩(wěn)定,將可上調(diào)細胞的數(shù)量和功能,達到治療自身免疫性疾病的作用。

[1]Kilshaw PJ,Brent L,Pinto M.Suppressor T cells in mice made unresponsive to skin allografts[J].Nature,1975,255:489

[2]Brunkow M E,Jeffery EW,Hjerrild KA,et al.Disruption of a new foxk-head/helix protein,scurfin,results in the fatal lymphoproliferactive disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet,2001,27(1):68-73

[3]Janson PC,Winerdal M E,Marits P,et al.FOXP3 promoter demethy lation reveals the committed Treg population in humans[J].P LoS one,2008,3(2):1612

[4]Zinner R,Albiezl H,Walter J,et al.Histone lysine methylation patterns in human cell types are arranged in distinct three dimensional nuclear zones[J].Histochem Cell Biol,2006,125(1-2):3-19