多柔比星腎病大鼠IL-18、IFN-γ及IL-4的表達及意義

王麗敏,張靜,羅巧華

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院兒科,黑龍江佳木斯 154003)

微小病變型腎病綜合征(minimal change nephritic syndrome,MCNS)是兒童原發(fā)腎病綜合征中最常見的病理類型,其發(fā)病機制目前尚不甚明了,多年來大部分MCNS患兒臨床上以糖皮質激素及環(huán)磷酰胺為代表的免疫抑制療法能夠有效控制腎病的發(fā)展,改善患者臨床癥狀,但同時也產生了很多副作用。因此,在嚴格掌握免疫抑制治療適應證的同時,我們應該探求新的更安全的治療方法。近年來輔助性T淋巴細胞亞群功能失衡與MCNS相互關系日益為人們重視。而白細胞介素18(IL-18)作為一種新發(fā)現(xiàn)的炎性因子,其與輔助性T淋巴細胞亞群功能的相關性也倍受關注。最近的研究亦發(fā)現(xiàn)MCNS患者血及尿中IL-18水平持續(xù)升高,提示IL-18在MCNS發(fā)病中起重要作用。因此,我們在多柔比星腎病模型中,測定血清和腎組織中Th1相關的IL-18及IFN-γ和 Th2相關的 IL-4的水平變化,初步探討多柔比星腎病大鼠IL-18、IFN-γ及 IL-4的表達及意義以尋求防治MCNS的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

86只雄性Wistar大鼠,清潔級,體重(100±20)g,由佳木斯大學實驗動物中心提供。注射用鹽酸多柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產);大鼠 IL-18、IFN-γ及 IL-4ELISA試劑盒(美國 R&D生物公司生產)。

1.2 模型制備及分組

大鼠隨機分二組:正常組,模型組。正常組40只,腎病組大鼠46只。注射用多柔比星10毫克/支,用生理鹽水稀釋為2mg/mL溶液,在非麻醉狀態(tài)下將大鼠固定于固定器中,參照王崢等[1]方法將腎病組一次性尾靜脈注射多柔比星5mg/kg,注射后第7天收集所有大鼠24h尿液,進行24h尿蛋白定量,尿蛋白＞30mg/24h為模型成功,不符合者3只予以剔除。實驗過程中,模型組大鼠共死亡3只,正常組無死亡。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 標本留取及細胞因子測定

實驗第7、14、28、42天將各組大鼠在乙醚淺麻醉下摘眼球采血5mL,分離血清、剖腹取腎,將右側腎組織勻漿后離心,取上清液 3mL,均置于-20℃冰箱保存以備做IL-18、IFN-γ、及IL-4的檢測。左側腎組織用10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋后,切片進行HE染色觀察腎組織變化。

1.3.2 24h尿蛋白檢測

分別在多柔比星注射后 6、13、27、41d將大鼠單獨喂養(yǎng)在代謝籠中,自由飲水,收集 24h尿液,記錄24h尿量。用全自動生化分析儀檢測24h尿蛋白定量。

1.3.3 血生化檢測

于實驗第42天乙醚麻醉大鼠,處死前摘眼球采血采血3mL,在離心機中離心取血清,用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 尿蛋白變化

模型組第7天大鼠出現(xiàn)蛋白尿,以后進行性升高。模型組24h尿蛋白定量較正常組明顯升高,呈現(xiàn)大量蛋白尿(P＜0.01)第42天尿蛋白量達高峰。見表1。

2.2 血生化指標

第42天模型組血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)顯著高于正常組(P＜0.01);總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)顯著低于正常組(P＜0.01);尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量各組間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠24h尿蛋白測定(mg/24h,± s,n=10)

表1 各組大鼠24h尿蛋白測定(mg/24h,± s,n=10)

注:與正常組比較★ P＜0.01;與模型組比較◆P＜0.01。

______分組 7d 14d 28d 42d正常組 5.99±0.72 5.96±0.78 6.06±0.72 5.94±0.76_____模型組 52.5±4.27★ 129.61±6.67★____________________________________________________________________________________________________________________250.38±11.55★_286.19±13.7★

表2 各組大鼠血清 T C、TG、ALb、TP、BUN、SCr水平(± s,n=10)

表2 各組大鼠血清 T C、TG、ALb、TP、BUN、SCr水平(± s,n=10)

注:與模型組比較★ P＜0.01。BUN和SCr含量各組間無顯著性差異(P＞0.05)。

____分組 TC(mmol/L)_________TG(mmol/L) A Lb(g/L) TP(g/L) BUN(μ mol/L) SCr(mmol/L)正常組 0.83±0.21★ 0.69±0.09★ 32.42±2.59★ 57.23±0.72★ 6.32±0.1 17.06±0.86___模型組_____________3.39±0.75________________2.2±0.03_____________________________________________________________________________________20.13±1.78_32.39±0.86_7.82±0.16_18.78±1.27

表3 各組大鼠血清及腎組織IL—18的水平(±s,pg/mL,n=10)

表3 各組大鼠血清及腎組織IL—18的水平(±s,pg/mL,n=10)

注:與正常組比較★P＜0.01;與正常組比較☆P＜0.01。

組別 血清IL-18腎組織IL-18正常組 模型組 正常組 模型組7d 260.25±8.09 387.20±12.96★ 320.71±12.29 421.75±5.18☆14d 254.69±11.66 526.79±40.10★ 310.03±6.98 589.50±13.66☆28d 261.54±8.12 750.38±43.80★ 319.96±9.44 809.09±16.28☆_____42d 253.59±9.50 871.35±14.82★_____________________________________________________________________________________________________________320.54±10.57_922.09±7.50☆

2.3 血清及腎組織細胞因子測定

2.3.1 血清及腎組織中IL-18、IFN-γ的表達

與正常組比較,模型組各期血清及腎組織中 IL-18、IFN-γ水平均升高(P＜0.01)。見表 3、表4。

2.3.2 血清及腎組織中IL-4的表達

與正常組比較,模型組各期血清及腎組織中IL-4水平均有所下降(P＜0.01)。見表5。

表4 各組大鼠血清及腎組織IFN—γ的水平(± s,pg/mL,n=10)

表4 各組大鼠血清及腎組織IFN—γ的水平(± s,pg/mL,n=10)

注:與正常組比較★ P＜0.01;與正常組比較☆P＜0.01。

組別 血清IFN-γ腎組織IFN-γ正常組 模型組 正常組 模型組7d 81.45±3.29 96.45±3.30★ 120.22±6.20 237.84±4.35☆14d 83.78±4.35 115.66±4.99★ 124.83±4.20 268.98±4.94☆28d 85.66±4.46 126.18±15.85★ 130.59±5.22 283.83±6.43☆_____42d 85.41±2.23 131.17±5.33★ 126.43±4.55_____________341.17±7.14☆

表5 各組大鼠血清及腎組織血清IL—4的水平(±s,pg/mL,n=10)

表5 各組大鼠血清及腎組織血清IL—4的水平(±s,pg/mL,n=10)

注:與正常組比較★ P＜0.01;與正常組比較☆P＜0.01。

組別 血清IL-4腎組織IL-4正常組 模型組 正常組 模型組7d 15.20±1.46 63.68±3.27★ 40.26±3.46 124.69±6.26☆14d 14.21±0.84 62.81±5.31★ 38.85±3.01 113.33±6.14☆28d 15.42±1.35 57.18±2.73★ 41.72±3.52 100.20±5.37☆_____42d 14.55±1.21 52.11±3.61★ 39.68±3.64______________90.80±5.20☆

3 討論

MCNS是一類以炎癥反應為主的自身免疫性疾病,有多種細胞因子參與其免疫病理過程,最近的研究表明,T細胞介導的免疫反應失衡牽涉到MCNS的發(fā)病。IL-18是一種強有力的免疫調節(jié)因子,它對多種細胞尤其免疫細胞有多向性作用,它具有強烈的促炎癥作用,它可以顯著刺激Th1細胞產生IFN-γ、IL-2等細胞因子,且活性高于IL-12,能與IL-12協(xié)同作用但又不互相依賴。IL-18同樣可以顯著增強抗CD3單抗、ConA和IL-2活化的外周血單個核細胞產生IFN-γ的活性,同時也可促進GM-CSF分泌,抑制IL-4、IL-10產生。同時臨床研究發(fā)現(xiàn)NS患者血和尿中IL-18水平異常增高,且與本病的臨床經(jīng)過平行相關。此外抑制IL-18釋放可以明顯降低VPF的合成。已證實VPF與NS蛋白尿的發(fā)生密切相關[2]。本試驗發(fā)現(xiàn)血清和腎臟IL-18和IFN-γ水平越高,尿蛋白就越重,說明 IL-18和IFN-γ的異常表達及量的增多與蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展密切相關。且IL-18及以Th1型為主的免疫失衡在MCNS發(fā)病中起重要作用。另外本研究顯示模型組血清及腎組織中IL-18水平顯著增高,且與IFN-γ水平呈正相關,而IL-4水平明顯降低。提示在MCNS發(fā)病過程中血清及腎組織IL-18增高促進了輔助性T淋巴細胞亞群平衡偏移,表現(xiàn)為Th1細胞活性升高,這可能是其發(fā)病機制之一。現(xiàn)代免疫學認為在不同的抗原、細胞因子或抗原遞呈細胞(APC)等因素作用下,可使 Th0細胞向Th1或Th2轉化或Th1細胞與Th2細胞之間發(fā)生轉化[3]。Th1以分泌IL-2、IL-12、INF-γ、TNF-α等促炎癥因子為主。Th2以分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等抗炎癥因子為主,其中 IL-4 和IFN-γ是維持Th1/Th2細胞比例的關鍵分子,IL-4對Th0細胞分化為Th1和 Th2起關鍵性調控作用。且IL-4是主要的Th2細胞因子[4],故試驗中常常檢測 IFN-γ和 IL-4來分別代表Th1和Th2的功能狀態(tài)。這兩類輔助性T細胞之間的動態(tài)平衡對維持機體正常的免疫功能起重要作用。Daniel[5]等人的實驗證實,兒童原發(fā)性腎病在發(fā)病期是以Th1細胞活化,而長期緩解期是以Th2細胞活化,Th1功能下調為特征的。Matsumoto[6]推測活動期MCN患者體內存在Th1細胞功能亢進/Th2細胞功能低下的紊亂模式。在本研究中,我們檢測不同時期模型組大鼠血清和腎組織中IL-18、IFN-γ和 IL-4,結果顯示不同時期模型組血清及腎組織中IL-18和IFN-γ水平顯著升高,而IL-4降低,這與Daniel等觀點一致。提示Th1/Th2失衡與MCNS發(fā)病相關,并且這種失衡與IL-18水平變化相關。

本實驗較好的模擬了人類的MCNS,從細胞因子的角度研究檢測了各個時期MCNS大鼠血清及腎組織中IL-18、IFN-γ和IL-4的水平。結果表明模型組血清及腎組織IL-18、IFN-γ水平與正常組相比也明顯升高,且IL-18、IFN-γ水平與24h尿蛋白定量之間呈顯著正相關,與相關報道一致。因此抑制或中和內源性IL-18的釋放及活性,糾正失衡的Th1/Th2有可能成為MCNS治療的新途徑。

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