灰樹花多糖聯合順鉑對H22荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡的影響

呂冬霞,杜 偉,范曉艷,張曉波

(佳木斯大學基礎醫學院生物學教研室,黑龍江佳木斯 154007)

細胞凋亡作為當今生物醫學研究中最引人注目的領域之一,正以驚人的速度取得令人矚目的進展。研究顯示灰樹花多糖可減少化學療法的副作用。順鉑是目前應用最廣泛的化療藥物之一,本研究通過測定腫瘤抑制率、HE染色和免疫組化檢測Caspase-3的表達,探討灰樹花多糖聯合順鉑對腫瘤細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

瘤株:H22肝癌細胞購于哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院動物中心;實驗動物:昆明種近交系小鼠,體重(20±2.0)g,雄性,佳木斯大學實驗動物中心提供,許可證號:黑動字第99101001,普通級,普通環境飼養?；覙浠ǘ嗵欠勰?浙江方格藥業有限公司,多糖含量90%)。順鉑粉劑(山東齊魯制藥廠)。Caspase-3抗體(河北博海生物)。SP-9001試劑盒(北京中杉金橋)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立、分組與給藥方式

40只昆明種小鼠各自接種1×107/mL細胞懸液于右側腋下,隨機分成4組,每組10只。24h,開始給藥。給藥時間為:每日早上進行灌胃一次,晚上進行腹腔注射一次,間隔時間12h,連續給藥14d。具體給藥方法見表1。

表1 實驗動物的給藥種類與用量

1.2.2 腫瘤抑制率

腫瘤抑制率(%)=(陰性組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/陰性組平均瘤重×100%。

1.2.3 HE染色

按說明書操作。

1.2.4 免疫組化

采用SP法。Caspase-3陽性為細胞膜和細胞漿著色。

1.3 統計分析

采用SPSS10.0統計軟件進行數據統計分析,結果以均數±標準差表示。采用完全隨機設計兩樣本均數比較t檢驗和方差分析,P＜0.05為有差異。

2 結果

2.1 腫瘤抑制率

表2 腫瘤抑制率(± s,n=10)

表2 腫瘤抑制率(± s,n=10)

注:與陰性組比較 * P＜0.05,**P＜0.01。

平均瘤重(g)___________腫瘤抑制率(%)陰性組 2.57±0.54 —灰樹花多糖組 1.58±0.31* 38.52順鉑組 1.08±0.12* 57.98聯合組 0.86±0.07** 66.54_______

2.2 HE染色

HE染色后在高倍鏡下觀察:陰性組的H22腫瘤細胞大小和形態很不一致,呈多形性,棱形或多邊形鋪層生長,可觀察到瘤巨細胞。細胞核的體積增大,核質比增高。出現巨核、雙核、多核或奇異形核。核仁明顯,體積大,數目增多,核分裂相增多,出現異常的核分裂相;各給藥治療組的H22腫瘤細胞與細胞間接觸的消失,但細胞膜依然完整。染色質固縮,形成新月形帽狀結構等形態,沿著核膜分布。可見凋亡小體的形成。

2.3 免疫組化

對免疫組化的片子進行顯微鏡觀察,caspase-3為細胞膜和細胞漿著色。采用免疫組化評分法,由2名觀察者對切片盲式閱片,顯微鏡下隨機選擇5個高倍鏡視野(×400),觀察所選擇視野中的所有細胞,記錄陽性染色細胞百分數并計分。評分標準如下:

A為陽性細胞數分級0～1%=0;1%～10%=1;10%～50%=2;50%～80%=3;80%～100%=4。

B為陽性細胞顯色強度分級 0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性)。

IHS=A×B

對所得數值進行完全隨機設計兩樣本均數比較t檢驗。

表3 小鼠實體瘤caspase-3表達(± s,n=10)

表3 小鼠實體瘤caspase-3表達(± s,n=10)

注:與對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01。

_級別 caspase-3陰性組 0.5556±0.0182灰樹花多糖組 1.0000±0.2042*順鉑組 1.8889±0.2936**_聯合組 3.3333±0.6933*________________*

3 討論

灰樹花多糖是從灰樹花子實體、菌絲體中提取的,具有增強免疫功能、抑制腫瘤、抗HIV病毒、穩定血壓、降低血糖、改善脂肪代謝等廣泛的生理活性[1]。有研究表明,PGF對體內S180肉瘤具有抑制作用[2]。通過HE染色在光鏡下觀察各組細胞形態,陰性組的H22腫瘤細胞呈棱形或多邊形鋪層生長,細胞分裂增殖活躍,多見分裂相;各給藥組的H22腫瘤細胞表現出典型的細胞凋亡特征,說明順鉑和灰樹花多糖均可誘導H22腫瘤細胞凋亡。Caspase被認為是細胞凋亡的核心執行者即凋亡的共同通路。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必經之路且位于該細胞級聯反應的下游,它通過下游效應因子切斷細胞間的信號傳遞,重組細胞骨架,關閉DNA復制和修復,破壞DNA和細胞核結構,誘導凋亡小體來執行凋亡功能[3]。本實驗結果說明灰樹花聯合順鉑抑制腫瘤生長與促進Caspase-3高表達有關。通過本實驗觀察到,灰樹花多糖組、順鉑組、聯合組均對H22細胞具有殺傷作用,以聯合組效果最明顯。各治療組均對腫瘤細胞有抑制作用,聯合組最強,其次為順鉑組,再次為灰樹花多糖組。聯合組抑瘤效果最佳,且小鼠生命力旺盛,說明灰樹花多糖對于順鉑有增敏作用,且明顯。

本研究提示順鉑、灰樹花多糖可以有效地抑制 H22腫瘤細胞的增殖,從而導致 H22腫瘤細胞大量凋亡。應用灰樹花多糖聯合順鉑具有一定的協同作用,在降低化療藥物毒副作用的同時有效誘導H22腫瘤細胞凋亡,提高綜合治療效果。綜合考慮灰樹花多糖的多種功效和高安全性,它具有可能成為腫瘤化療輔助劑的巨大潛力。

[1]Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential[J].Altern Med Rev,2001,6(1):48-60

[2]杜景衛,夏作理,李清初,等.灰樹花多糖抗S180肉瘤的實驗研究[J].泰山醫學院學報,2005,25(2):193-195

[3]Nicholson DW,Thornberry NA.Caspases:killer proteases[J].Trends Biochem Sci,1997,22(8):299-306