母體血漿游離HLCS基因用于無創傷性產前診斷DS的研究

王鳳雙,王淑秋

(佳木斯大學基礎醫學院,黑龍江佳木斯 154007)

唐氏綜合征,又名21三體或先天愚型,屬于常染色體遺傳病。有三種分型:游離型、異位型和嵌合型。三種分型臨床表現嚴重程度不一樣,但是通常都表現出智力低下、特殊面容、不育、身材矮小、頸椎脆弱、常伴有先天性心臟病或其他器官畸形。DS患兒的出生為患者個人、家庭、社會造成沉重的經濟負擔和強大精神壓力。再者,DS患兒的出生率較高,是常見的非整倍體遺傳病之一,引起全世界的普遍關注。目前臨床上能夠做的就是康復性訓練,但效果不佳。所以進行產前診斷,預防此類患兒的出生時目前解決這一問題的最好手段,實踐證明也是有效的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

QIAmp DNA Blood Mini Kit,Blood Genome DNA Extraction Kit,Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0,PrimeSTAR○HS DNA Polymerase,BstUI內切酶,引物,硼酸,EDTA,T ris-base,無水乙醇。

1.2 實驗方法

隨機選取2008—09～2011—03來我院進行產前診斷的健康孕婦20例,孕周 12～15周,年齡22～34歲,每例孕婦采取外周血3.0mL;DS孕婦7例,孕周12～18周,年齡25～36歲,采取外周血3.0mL。另外采取一名非足月終止妊娠的DS患兒絨毛膜組織,提取DNA,作為陽性對照,無菌蒸餾水作為空白對照。根據胎兒來源和母體來源的HLCS和RASSF1的甲基化程度不同,提取DNA經甲基化敏感性內切酶BstUI消化后,PCR擴增,比較健康和DS孕婦HLCS的相對劑量大小。本實驗提前征得實驗參與人員或家屬知情同意,保證研究結果對外保密。

1.3 統計學處理

實驗所得計量資料用采用SPSS15.0軟件進行Mann-Whitney U分析,P＜0.05有顯著性意義。

2 結果

2.1 BstUI酶切后PCR結果

見圖1,2。

圖1 M 為100bp Marker,1為DS孕婦血漿樣本,2為DS孕婦外周血樣本,3為健康孕婦血漿樣本,4為健康孕婦外周血樣本,5為DS陽性對照,6為空白對照。130bp的是 RASSF1的PCR產物,96bp的是HLCS的PCR產物。

2.2 健康和DS孕婦血漿中HLCS/RASSF1的劑量變化

經統計學分析P＜0.01,兩組間HLCS相對劑量差異顯著。

3 討論

已經有不少文獻報道了孕婦外周血血漿或血清中非細胞游離胎兒DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的存在[1,2]。實質上孕婦外周血血漿中的游離DNA包括兩部分:妊娠期間胎兒和母體非細胞游離DNA均可以在母體外周血中檢測到,且胎兒DNA可以在妊娠32天的血漿中檢測到。cffDNA較容易提取,利用熒光定量PCR技術可以較容易的定量。眾多周知,非細胞游離胎兒DNA是以片段的形式存在,且短于母體起源的DNA片段。除此之外,還可以肯定的是胎兒DNA存在于破裂的凋亡小體的核小體中。母體外周血中cffDNA的濃度隨妊娠期的增加而增加。孕早期時cffDNA的水平每周增長約21%,孕中期時達到峰值,分娩前急劇上升。健康孕婦分娩后16～30min后,cffDNA迅速消失。這一快速轉變表明胎兒DNA進入母體血漿循環是持續的,為胎兒DNA產生、清除提供了實時畫面。因此cffDNA是一種妊娠的生物標記物。通過母體血漿核酸分析檢測DS主要有兩類方法。第一類包括胎兒特異性核酸標記物[3]SNPs等位基因比例的分析。這類方法的例子包括胎盤來源mRNA的分析(RNA-SNP法)[4]和DNA甲基化標記物分析(表觀遺傳學等位基因比例法)。等位基因比例分析的主要不足之處在于這種方法只適用于胎兒該位點是雜合子的情況。第二類方法是利用單核酸分子計數法,例如數字化PCR和大量平行基因組測序[5,6]。在這些方法中,個體血漿DNA分子數目測定出來。這些方法的準確性可以檢測到孕婦血漿中DS引起的胎盤起源DNA分子的微量上調。后種方法的一個不足之處在于大量分子的計數需要胎兒非特異性的標記物,例如21號染色體的隨機序列,不足之處在于需要昂貴的試劑盒設備以及相對復雜的生物信息學手段。Yu K.Tong.等[7]在一系列胎兒起源的血漿游離DNA甲基化篩查中發現了HLCS基因調控區是高度甲基化的,而相反的是母體來源的血漿HLCS基因調控區是非甲基化的。這就為分離胎兒來源的母體血漿HLCS DNA提供了途徑,為基于CFF-DNA的產前診斷提供了有一條線索。我們利用甲基化敏感性內切酶BstUI,識別CGCG序列,如果該位點有甲基化,則切不斷該序列,如果改位點沒有甲基化,則該序列被切斷。所有樣本經BstUI酶切后,進行 HLCS PCR擴增,由于母源血漿游離 HLCS基因片段是非甲基化的,所以在BstUI酶切過程中被切斷,而胎兒來源的被保留下來。酶切是否完全由β-actin PCR擴增結果來驗證。酶切完全時,β-actin PCR不會出現預期結果,相反的話就是酶切不完全。本實驗結果證明DS孕婦血漿HLCS基因片段拷貝數和健康孕婦血漿HLCS基因片段拷貝數的差別具有顯著意義(P＜0.01),HLCS基因可以成為未來無創傷性產前診斷的潛在標記物。由于本實驗樣本量不夠大,且指標單一,基因拷貝數計算方法不夠尖端,所以胎兒來源血漿游離甲基化基因片段用于產前診斷需要廣泛、且深入的研究。另外CFFDNA用于產前診斷具有幾大優勢:①無創傷性;②周期短,一邊核型分析至少需要2周時間;③可以做到早期產前診斷;④經濟成本低,操作便捷。總之,CFF-DNA用于產前診斷前景光明。

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