高效液相色譜法測定小鼠血漿中黃芩苷含量及其藥代動力學研究

王 麗，周慧芳，張艷軍，莊鵬偉

(天津中醫藥大學，天津 300193)

黃芩苷為黃酮類化合物，是唇形科植物黃芩的主要有效成分之一，其含量較多，屬葡萄糖醛酸苷化合物，并具有廣泛的藥理作用,如抗炎、抗病毒、保肝和解熱等[1]。近些年，通過大量的實驗證明，黃芩苷還具有抗實驗性心律失常、抗腫瘤、抗氧化作用和對鈣離子的作用等。黃芩苷在臨床上應用廣泛，現已被研制出多種劑型。研究黃芩苷在體內代謝過程對其藥效機理和臨床用藥具有重要的指導作用。本實驗運用高效液相色譜法，測定黃芩苷在小鼠血漿的濃度變化規律并進行藥代動力學分析[2-4]。

1 材料

1.1 對照品 黃芩苷對照品，中國藥品生物制品鑒定所，批號07159708。

1.2 試劑 甲醇(色譜純，天津市協和昊鵬色譜科技有限公司)；乙腈(色譜純，天津市協和昊鵬色譜科技有限公司)；磷酸(分析純，天津市化學試劑三廠)；色譜分析用水(娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司)；肝素鈉注射液(天津市生物化學制藥廠，批號H12020505)；乙醚(天津化學試劑廠)。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體質量(25±2)g,天津市山川紅實驗動物科技有限公司提供。

1.4 儀器 SOFTA6000高效液相色譜系統;KQ-100A型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);XS204分析天平(METTLER TOLEDO)。

2 方法學考察

2.1 色譜條件 C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(含0.05%的磷酸)(75∶25, V/V)，檢測波長278 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

2.2 對照品儲備溶液的配制 用甲醇配制濃度為100 μg/mL的黃芩苷對照品溶液。

2.3 血漿樣品預處理 取小鼠血1 mL至肝素鈉試管中,離心后得空白血漿。取空白血漿100 μL，加入400 μL甲醇，于微型旋渦混合儀混合30 s，10 000 r/min離心，取上清液，氮氣吹干，加入300 μL甲醇渦旋混合，取20 μL進樣。

2.4 標準曲線的制備、最低檢測限與定量限考察 取黃芩苷對照品儲備溶液,配制成黃芩苷25、5、1、0.25、0.1、0.05、0.025 μg/mL的系列溶液,分別進行測定。以峰面積(Y)對濃度(X)作線性回歸，得線性范圍和回歸方程，見表1，圖1。

圖1 黃芩苷的標準曲線

取對照品溶液,以流動相稀釋,按“1.2.1”項下色譜條件測定。以信噪比等于10計算,黃芩苷的最低定量限為0.036 87 μg/mL。

表1 黃芩苷線性關系

2.5 精密度試驗 配制黃芩苷低、中、高3個濃度的對照品樣品混合溶液，按“血漿樣品預處理方法”處理樣品，分別進行測定。同一濃度每隔1 h測定1次，測5次,計算日內精密度；每隔1 d測定1次，測5 d，計算日間精密度。結果見表2。

表2 血漿樣品中的精密度

試驗結果表明,黃芩苷的低、中、高3種濃度在血漿中的日內、日間精密度均符合要求。

2.6 回收率試驗 配制黃芩苷低、中、高3個濃度的對照品混合溶液，按“血漿樣品預處理方法”處理樣品，分別進行測定。按照對照品測得量和加入量之比計算回收率。結果見表3。

表3 血漿樣品中的回收率

試驗結果表明，黃芩苷的低、中、高3種濃度在血漿中的回收率符合要求。

2.7 穩定性試驗 取黃芩苷對照品儲備液，45 ℃以下氮氣吹干，加入200 μL空白血漿，配制成血漿樣品中含黃芩苷1 μg/mL的溶液，按“血漿樣品預處理方法”處理樣品，將所配藥液于冰箱中冷藏，分別在0、1、2、4、6、8 h進行測定。以對照品測得量計算相對標準偏差。結果見表4。

表4 血漿樣品中的穩定性

試驗結果表明,黃芩苷的低、中、高3種濃度在血漿及腦組織中8 h的穩定性符合要求。

圖2 黃芩苷對照品色譜圖

圖3 空白血樣色譜圖

圖4 加藥后血樣色譜圖

2.8 專屬性試驗 在1.2.1項下的色譜條件下, 測定黃芩苷對照品、空白血樣及加藥后血樣，見圖2～圖4。

由圖可知黃芩苷的保留時間約為6 min,空白腦組織中的內源性物質不干擾黃芩苷在腦組織中濃度的分析。

3 樣品的測定及藥動學參數計算

3.1 黃芩苷在正常小鼠血漿中濃度的測定 健康小鼠60只，隨機分組,每組設置10個取樣點，每個取樣點6只小鼠。正常小鼠給藥前禁食不禁水12 h，按25 mg/1 000 g的劑量尾靜脈給予黃芩苷，分別于給藥后的5、15、30、60、90、120、180、240、360、480 min[5]采血0.5 mL左右，離心，取血漿。打開小鼠胸腔，用生理鹽水從左心室灌注，取腦組織(每一時間點取一只小鼠)。稱重后置玻璃勻漿器中勻漿。按“血漿及腦組織樣品預處理方法”處理樣品，進行測定。以峰面積計算黃芩苷在正常小鼠血漿和腦組織中不同時間的藥物濃度數據見表5，其藥物濃度-時間曲線見圖5。

圖5 黃芩苷在正常小鼠血漿中的藥-時曲線

表5 黃芩苷在正常小鼠血漿及腦組織中的血藥濃度

3.2 黃芩苷在正常小鼠體內的藥代動力學參數 采用中國藥理學會數學藥理委員會編制的DAS1.0實用藥代動力學軟件處理血藥濃度數據,分別按一二三室模型進行模擬，獲得AIC值和相關系數r。根據AIC值最小和r值最大原則，判定黃芩苷在正常型小鼠血漿中的藥-時過程均符合二室開放模型[6]。并求得其藥代動力學參數，結果見表6。

4 討論

在優化HPLC色譜條件時，本研究比較了乙腈、甲醇等溶劑與水按不同比例混合及磷酸的濃度配制成流動相的分離效果,結果表明選用乙腈-水溶液(75∶25)含0.05%的磷酸[7]為流動相可以很好地分離黃芩苷，且峰型較好、保留時間恰當,分離效果良好,血漿內源性物質及其他雜質不干擾樣品的分離測定。

表6 黃芩苷在正常小鼠血漿主要藥代動力學參數(隔室模型,

H在優化萃取條件的過程中，本實驗比較了甲醇、乙腈、高氯酸等溶劑的萃取效果，發現甲醇效果最好，黃芩苷峰形較好，且回收率較高，故選用甲醇對小鼠血清中的黃芩苷進行萃取。

本實驗建立了高效液相色譜法測定小鼠血漿中黃芩苷含量的方法，實驗證明，本方法能夠有效地測定藥物在血漿中含量的變化情況及其藥代動力學研究，靈敏度高，重現性好，操作簡便快捷，對準確考察黃芩苷對大鼠藥代動力學的作用具有指導意義。

[1]張喜平,田華,程琪輝.黃芩苷的藥理作用研究現狀[J].中國藥理學通報,2003,19(11):1212-1215.

[2]文敏,李雪,付守廷.黃芩苷藥理作用研究新進展[J].沈陽藥科大學學報,2008,25(2):158-162.

[3]申去非,張莉,朱鐵梁,等.黃芩苷含量測定方法研究進展[J].中醫藥信息,2009,26(4):14-16.

[4]萬麗麗,郭澄.野黃芩苷藥動學研究進展[J].中國藥房,2007,18(30):2385-2387.

[5]Huifeng Huang,Yu Zhang,Rui Yang,et al.Determination of baicalin in rat cerebrospinal uid and blood using microdialysis coupled with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2008,874:77-83.

[6]殷志爽,王維聰,游遠,等.HPLC測定大鼠血清中靛玉紅的含量及其藥代動力學研究[J].中國中藥雜志,2010,35(9):1148-1151.

[7]茍小軍.HPLC法測定平肝降壓片中黃芩苷的含量[J].吉林中醫藥,2005,25(12):55.