HBx和HIF-1α在肝癌血管生成中的關(guān)系及臨床意義

劉凱歌， 許剛柱， 趙 慧， 徐 莉， 徐 銳， 姚 楊 (西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科， 西安 710077; 通訊作者，E-mail:kaigeliu@gmail.com)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，HBV作為HCC的致病因子已被公認(rèn)，HBV的X基因編碼產(chǎn)物X蛋白(HBx)在HBV相關(guān)肝細(xì)胞肝癌形成、發(fā)展和浸潤中發(fā)揮重要作用［1－3］。缺氧誘導(dǎo)因子 －1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)作為真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，其α亞單位HIF-1α存在于缺氧細(xì)胞的細(xì)胞核中，參與缺氧誘導(dǎo)的特異反應(yīng)，促進(jìn)多種基因轉(zhuǎn)錄，而且還能夠誘導(dǎo)多種參與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的酶的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［4－6］。HCC是一高度血管化的腫瘤，作為HCC高危因素的HBx和腫瘤相關(guān)分子HIF-1α對其惡性生物行為的作用如何?本研究檢測了84例乙肝相關(guān)性肝癌組織和22例非乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx、HIF-1α及血管內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原(CD34)的表達(dá)，通過肝癌組織中微血管密度(MVD)所見，探討HBx和與HIF-1α乙肝相關(guān)性肝癌組織血管生成及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 106例人肝細(xì)胞肝癌組織來源于2003－01～2006－03西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院手術(shù)切除病理標(biāo)本，所有病例術(shù)前均未行化療、放療及其他輔助治療。主要試劑:HIF-1α單克隆抗體及HBx單克隆抗體(美國Neo-Markers公司產(chǎn)品)，CD34抗體(北京中杉生物工程有限公司產(chǎn)品);免疫組化SP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品)。

1.2 免疫組織化學(xué) SP法檢測人肝細(xì)胞肝癌組織中HIF-1的表達(dá)。按常規(guī)步驟進(jìn)行，其中鼠抗HBx單克隆抗體滴度為1∶400，HIF-1α及CD34抗體滴度均為1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:陽性表達(dá)判定參照文獻(xiàn)采用半定量積分法，即對每張切片的陽性細(xì)胞率及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級記分，然后根據(jù)兩項之和確定其陽性強(qiáng)度。僅細(xì)胞核著藍(lán)色者為陰性，胞膜、胞質(zhì)或胞核呈棕黃色者為陽性。0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強(qiáng)陽性。陽性細(xì)胞率即陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的比例，以計數(shù)10個高倍視野細(xì)胞為準(zhǔn)，陽性細(xì)胞≤5%為0分，6% －30%為1分，31% －70%為2分，≥71%為3分。兩項之和1－3分為低表達(dá)，4－6分為高表達(dá)。MVD計算參照Weidner［7］方法，即先在低倍鏡下觀察切片全視野，選擇血管內(nèi)皮細(xì)胞染色最多的視野，高倍鏡下記數(shù)3個視野的微血管數(shù)，取其平均值作為MVD。

2 結(jié)果

2.1 HBx的表達(dá) 84例乙肝相關(guān)性肝癌組織HBx陽性表達(dá)率73.81%(62/84)，陽性表達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色(圖1)，陰性表達(dá)22例，HBx在低分化組陽性率低于高分化組(P＜0.05)。62例陽性表達(dá)者中，早期癌占 66.13%(41/62)，進(jìn)展癌占 33.87%(21/62)，早期癌高于進(jìn)展期癌，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 HBx在高分化肝癌組織(A)、低分化肝癌(B，左上)和癌旁組織(B，右下)中的表達(dá) (×200)Fig 1 The expression of HBx in well differentiated(A)，poorly differentiated(B，upper left)and pericancerous tissues(B，lower right)(×200)

2.2 HIF-1α的表達(dá) HIF-1α陽性表達(dá)細(xì)胞以胞質(zhì)為主，呈棕黃色(圖2)。62例HBx陽性表達(dá)組中的HIF-1α 陽性率為 69.39%(43/62)，明顯高于HBx陰性表達(dá)組40.91%(9/22)和非乙肝相關(guān)性肝癌組36.36%(8/22)(P ＜0.05);HBx陰性表達(dá)的乙肝相關(guān)性肝癌組和非乙肝相關(guān)性肝癌組中HIF-1α陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但HIF-1α陽性表達(dá)在進(jìn)展期癌高于早期癌，隨著腫瘤體積的增大、組織分化程度的升高，陽性表達(dá)率升高，且轉(zhuǎn)移組表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移組。

圖2 HIF-1α在高分化肝癌組織(A)和低分化肝癌組織(B)中的表達(dá)(×200)Fig 2 The expression of VEGF in well differentiated(A)and poorly differentiated(B)hepatocellular carcinoma tissues(×200)

2.3 MVD計數(shù) CD34抗體陽性細(xì)胞呈棕黃色表達(dá)，多在毛細(xì)微血管的內(nèi)皮細(xì)胞核表達(dá)(圖3)。62例HBx陽性表達(dá)組中 MVD平均計數(shù)為50.19±16.62;其中21例早期癌MVD平均計數(shù)為42.37±12.75，41例進(jìn)展期癌 MVD平均計數(shù)為55.72±17.30，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。HBx陰性表達(dá)的乙肝相關(guān)性肝癌組MVD平均計數(shù)為38.42 ±8.67，非乙肝相關(guān)性肝癌組為 30.38 ±4.99，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，而HBx陽性表達(dá)組MVD平均計數(shù)與前二者比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。HIF-1α陽性組MVD高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(51.56±17.79 vs 34.25 ±12.36，P ＜0.05)。

圖3 CD34在早期(A)和進(jìn)展期(B)肝癌組織中的表達(dá)(×200)Fig 3 The expression of CD34 in earlier(A)and advanced(B)hepatocellular carcinoma tissues

2.4 HBx、HIF-1α 及 MVD的關(guān)系 在84例肝癌組織中，HBx和 HIF-1同時陽性占51.19%(43/84)，同時陰性占15.48%(13/84)。相關(guān)性分析表明，HBx與 HIF-1α 表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.573，P ＜0.01)。HBx高表達(dá)組MVD高于低表達(dá)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(51.89 ±19.32 vs 50.72 ±13.77，P ＞0.05);HIF-1α高表達(dá)組MVD低于低表達(dá)組，差異亦未見統(tǒng)計學(xué)意義(44.23±15.12 vs 62.23±18.45，P ＞0.05);HBx陽性表達(dá)組 MVD 值明顯高于HBx陰性組和非乙肝相關(guān)性肝癌組(P＜0.01)，有轉(zhuǎn)移組MVD高于無轉(zhuǎn)移組(P＜0.01);有門脈侵犯組高于無侵犯組(P＜0.05)。

2.5 乙肝相關(guān)性肝癌中HBx、HIF-1α表達(dá)及MVD計數(shù)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 HBx、HIF-1α的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)及腫瘤包膜浸潤無明顯相關(guān)，但與門靜脈侵襲轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)(P＜0.05，見表1)。MVD高分化組表達(dá)陽性率高于低分化組(P＜0.05);淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組高于無轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。單因素方差分析TMN各期間MVD計數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01 －0.05，見表1)。

表1 乙肝相關(guān)性肝癌中HBx、HIF-1α表達(dá)及MVD計數(shù)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab 1 Relationship of HBx，HIF-1α and MVD with the clinicopathological features in HBV-related hepetocellular carcinoma

3 討論

HBx是乙肝病毒的X開放讀框編碼的乙肝病毒X蛋白，是一種重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，它具有廣泛的反式激活作用，能夠影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活多種病毒及細(xì)胞基因啟動子，干擾細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，影響細(xì)胞分化和增殖等生物學(xué)功能，是乙肝相關(guān)性HCC的一個主要因素，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系非常密切［8，9］。腫瘤細(xì)胞快速生長、浸潤必然造成腫瘤組織缺氧，缺氧導(dǎo)致多種氧反應(yīng)基因表達(dá)上調(diào)，其中以HIF-1的表達(dá)最為敏感。在缺氧條件下表達(dá)增加的轉(zhuǎn)錄因子HIF-lα在介導(dǎo)腫瘤缺氧適應(yīng)過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用［10］，與腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本實驗結(jié)果提示HBx和HIF-1α廣泛表達(dá)于乙肝相關(guān)性肝癌組織中，HBx陽性表達(dá)在早期癌高于進(jìn)展期癌，而HIF-1α陽性表達(dá)在進(jìn)展期癌高于早期癌;HBx陽性表達(dá)組中的HIF-1α陽性率明顯高于HBx陰性表達(dá)組和非乙肝相關(guān)性肝癌組，這些提示HBx和HIF-1α的表達(dá)增高是肝癌發(fā)生中的重要生物事件。

血管形成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，新生血管為腫瘤生長提供足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，是腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移中不可或缺的重要因素。目前評價人類腫瘤血管形成的較好辦法仍是微血管定量，本實驗應(yīng)用免疫組化法通過CD34表達(dá)檢測MVD，分析HBx、HIF-1α及MVD的關(guān)系發(fā)現(xiàn):HBx陽性表達(dá)組MVD明顯高于HBx陰性組和非乙肝相關(guān)性肝癌組，進(jìn)展期癌組的MVD高于早期癌組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和有血管侵犯組的MVD也明顯高于陰性組，提示HBx蛋白的高表達(dá)在肝癌組織血管生成及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，而HIF-1α表達(dá)及MVD計數(shù)與臨床病理指標(biāo)的結(jié)果分析同樣說明HIF-1α在肝癌血管生成及轉(zhuǎn)移過程中也起著促進(jìn)作用，兩種蛋白可能在肝癌組織血管生成及轉(zhuǎn)移過程中具有協(xié)同作用。

通過本實驗還發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中HBx與HIF-1α表達(dá)呈現(xiàn)高度的相關(guān)性。Moon等［11］發(fā)現(xiàn)HBx有可能通過穩(wěn)定HIF-1α而誘導(dǎo)腫瘤血管生成;我們的研究也發(fā)現(xiàn)HBx可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)在乙肝相關(guān)性肝癌組織血管生成及轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用［3］，并且證實 HBx可上調(diào) HIF-1α［12］，說明在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中，HBx可能通過上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移。

［1］ Zhang X，Zhang H，Ye L.Effects of hepatitis B virus X protein on the development of liver cancer［J］.J Lab Clin Med，2006，147(2):58－66.

［2］ Tang H，Oishi N，Kaneko S，et al.Molecular functions and biological roles of hepatitis B virus X protein［J］.Cancer Sci，2006，97(10):977－983.

［3］ 劉凱歌，高紅艷，趙 慧，等.HBx和VEGF與乙肝相關(guān)性肝癌組織血管生成及轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2010，36(2):372 －376.

［4］ Goda N，Dozier SJ，Johnson RS.HIF-1 in cell cycle regulation，apoptosis，and tumor progression［J］.Anti Red Sig，2003，5(4):467－473.

［5］ Ogane N，Yasuda M，Shimizu M，et al.Clinicopathological implications of expressions of hypoxia-related molecules in esophageal superficial squamous cell carcinoma［J］.Ann Diagn Pathol，2010，14(1):23 －29.

［6］ Denko NC.Hypoxia，HIF1 and glucose metabolism in the solid tumour［J］.Nat Rev Cancer，2008，8(9):705 －713.

［7］ Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors［J］.Breast Cancer Res Treat，1995，36(2):169 － 180.

［8］ Tang H，Delgermaa I，Huang F，et al.The transcriptional transactivation function of HBx protein is important for its augmentation role in Hepatitis B virus replication［J］.J Virol，2005，79(9):5548－5556.

［9］ Bouchard MI，Wang I，Schneider RJ.Activation of focal adhesion kinase by hepatitis B virus HBx protein multiple functions in viral replication［J］.J Virol，2006，80(9):4406 －4414.

［10］ Ke Q，Costa M.Hypoxia-inducible factor-1(HIF-1)［J］.Mol Pharmacol，2006，70(5):1469 －1480.

［11］ Moon EJ，Jeong CH，Jeong JW，et al.Hepatitis B virus X protein induces angiogenesis by stabilizing hypoxia-inducible factor-1 alpha［J］.FASEB J，2004，18(2):382 －384.

［12］ Xie H，Song J，Liu K，et al.The expression of hypoxia-inducible factor-1alpha in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma:correlation with patients’prognosis and hepatitis B virus X protein［J］.Dig Dis Sci，2008，53(12):3225 －3233.