甲狀腺激素對(duì)大鼠腦海馬發(fā)育期神經(jīng)元煙堿受體α4亞單位表達(dá)的影響

練 濤， 李昭英 (山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院康復(fù)科， 太原 03000;山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科)

甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)是調(diào)控腦發(fā)育的關(guān)鍵性激素。在腦發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)，若TH缺乏將引起嚴(yán)重的腦損害［1］。突觸是神經(jīng)元之間進(jìn)行信息交換的特殊部位和重要結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是神經(jīng)系統(tǒng)功能得以體現(xiàn)的基礎(chǔ)及記憶形成的關(guān)鍵部位。神經(jīng)元煙堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)是由乙酰膽堿控制開(kāi)放的陽(yáng)離子通道，是許多中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能信號(hào)傳遞的關(guān)鍵分子。該受體由多種亞基組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。nAChR分布于突觸前和突觸后的不同部位，參與突觸信號(hào)的傳遞。突觸前受體調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放(乙酰膽堿等)，突觸后受體介導(dǎo)快速突觸傳遞，參與大腦的認(rèn)知、注意力、覺(jué)醒、疼痛的控制、感覺(jué)運(yùn)動(dòng)的調(diào)制和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等功能［2，3］。近年大量的研究表明，nAChR在學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知行為中有重要的作用，但它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的生理功能和作用機(jī)制仍不十分清楚［4］。學(xué)習(xí)、記憶功能與中樞膽堿能系統(tǒng)的關(guān)系早已受到注意。但是，長(zhǎng)期以來(lái)人們一直將注意力放在M型膽堿能系統(tǒng)，對(duì)nAChR的作用了解較少。nAChR是由α、β兩種亞基組成的五聚體蛋白，中樞nAChR一般認(rèn)為由2個(gè)α亞單位和3個(gè)β亞單位組合而成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最廣泛表達(dá)的亞型是α4β2。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為nAChR上的α亞單位和受體激動(dòng)劑結(jié)合屬于功能亞單位。β亞單位屬于結(jié)構(gòu)亞單位，維持nAChR結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［5］。神經(jīng)元nAChR主要分布在不同的區(qū)域:灰質(zhì)、基底神經(jīng)節(jié)、丘腦、海馬、大腦、視網(wǎng)膜以及雞視葉［6］。目前關(guān)于受體亞型總區(qū)域定位的研究主要以原位雜交研究為基礎(chǔ)。有研究表明［7］，中樞膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育及分布可以控制海馬區(qū)域nAChRα4受體的表達(dá)，而且nAChRα4的時(shí)空表達(dá)影響了海馬錐體細(xì)胞突觸的發(fā)生以及相關(guān)神經(jīng)回路的建立。此外，近年研究表明，中樞膽堿能神經(jīng)元對(duì)甲狀腺激素水平的改變比較敏感，在腦發(fā)育臨界期，甲狀腺激素水平的異常使膽堿能神經(jīng)元的增殖、遷移、分化過(guò)程受到影響，造成中樞膽堿能神經(jīng)發(fā)育障礙。因此，本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)在不同甲狀腺激素水平狀態(tài)下動(dòng)態(tài)觀察nAChRα4表達(dá)的變化規(guī)律，進(jìn)一步揭示甲狀腺激素水平異常造成腦發(fā)育障礙的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Wistar雄、雌大鼠，記錄每天飲水量。若每只鼠間平均進(jìn)水量相差＜10%，可認(rèn)為這批鼠飲水量一致。隨機(jī)分成2個(gè)組:正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)性甲減組。實(shí)驗(yàn)性甲減組模型復(fù)制參照李昭瑛等［1］方法，孕鼠自妊娠第5天起給予含甲巰咪唑(5 mg/片，北京太洋藥業(yè)有限公司)飲水，劑量為200 mg/L(0.02%甲巰咪唑飲水)，出生仔鼠為先天甲減鼠，直至動(dòng)物處死。全部動(dòng)物用相同飼料喂養(yǎng)，飲用自來(lái)水。

1.2 方法 正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)性甲減組仔鼠分別于生后第 0，4，7，14，21，30，120 天分批斷頭處死，每組6只。收集血清測(cè)定FT3、FT4。腦組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛(含1/1 000的DEPC)固定，常規(guī)石蠟包埋、保存。原位雜交連續(xù)切片，片厚6 μm。原位雜交法檢測(cè)nAChRα4(經(jīng)地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針)表達(dá)。原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用PBS液代替雜交液作陰性對(duì)照組。

1.3 結(jié)果判定 nAChRα4 mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀標(biāo)記。

1.4 圖像分析 參照Swanson［8］大腦圖譜，每個(gè)大鼠取含海馬切片6張。采用四川大學(xué)圖像圖形研究所MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)海馬nAChRα4反應(yīng)產(chǎn)物的光密度值(optical density，OD)，同時(shí)測(cè)定相應(yīng)每張切片胼胝體ODb值作背景，反應(yīng)產(chǎn)物的OD值減去背景ODb值得到校正OD值(corrected optical density，COD)，即 nAChRα4 反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)際光密度值。用COD值進(jìn)行比較分析，以避免非特異性染色所造成的誤差。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型 正常對(duì)照組仔鼠體重增加較快，活動(dòng)性強(qiáng)，毛發(fā)發(fā)育正常;甲減組仔鼠體重增加慢，體形小，尾短，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，開(kāi)眼晚，毛發(fā)萌出晚且稀疏。根據(jù)發(fā)育癥狀、體征及血清學(xué)檢測(cè)說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)建立的模型是成功的。各組仔鼠體重、血FT3、FT4水平變化見(jiàn)表1。

表1 各組動(dòng)物不同鼠齡體重及血清FT3、FT4水平Tab 1 Serum levels of body weight，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4 in each group

2.2 nAChRα4原位雜交的測(cè)定 原位雜交結(jié)果顯示，正常對(duì)照組海馬各區(qū)均未見(jiàn)棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀標(biāo)記物(見(jiàn)圖1)。海馬各區(qū)nAChRα4 mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀標(biāo)記，神經(jīng)元胞體、膠質(zhì)細(xì)胞、白質(zhì)及血管均不被標(biāo)記(見(jiàn)圖2)。

圖1 正常大鼠海馬nAChRα4 mRNA表達(dá)，未見(jiàn)棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀標(biāo)記物(原位雜交，×40)Fig 1 The nAChRα4 mRNA expression in hippocampus of the normal rats(in situ hybridization，×40)

圖2 出生后第4天正常大鼠海馬nAChRα4 mRNA表達(dá)，見(jiàn)棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀標(biāo)記物(原位雜交，×40)Fig 2 The nAChRα4 mRNA expression in hippocampus of the normal rats at postnatal day 4(in situ hybridization，×40)

神經(jīng)元煙堿受體(nAChRα4)mRNA在腦海馬各區(qū)域表達(dá)呈板層樣分布且模式基本相同(見(jiàn)圖2，3)。海馬各區(qū)在生后第0天表達(dá)很低，海馬CA1區(qū)陽(yáng)性信號(hào)在生后第21天表達(dá)高峰是成年鼠(生后120 d水平)的4－5倍，海馬CA2、CA3區(qū)陽(yáng)性信號(hào)在P21 d表達(dá)高峰是成年鼠(生后120 d水平)的8倍左右，海馬齒狀回(DG)區(qū)在P14 d陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)高峰是成年鼠(生后120 d水平)的5倍左右，見(jiàn)表2。以后各區(qū)均隨日齡的增加表達(dá)逐漸減少直至成年鼠水平(生后120 d水平)。

圖3 出生后第4天正常大鼠海馬CA1區(qū)nAChRα4 mRNA表達(dá)，見(jiàn)棕黃色顆粒狀或點(diǎn)狀標(biāo)記物 (原位雜交，×200)Fig 3 The nAChRα4 mRNA expression in CA1 of the normal rats at postnatal day 4(in situ hybridization，×200)

甲減組腦海馬各區(qū)域nAChRα4mRNA表達(dá)也呈動(dòng)態(tài)發(fā)育變化模式，在各時(shí)點(diǎn)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)均明顯低于同日齡正常對(duì)照組(P＜0.001，見(jiàn)表2)。甲減組與正常對(duì)照組表達(dá)的高峰時(shí)間相一致。

表2 各組不同日齡nAChRα4mRNA原位雜交COD值變化Tab 2 Changes of corrected optical density value of nAChRα4 mRNA expression by in situ hybridization in different postnatal day groups

3 討論

在腦發(fā)育過(guò)程中，突觸的形成是一個(gè)關(guān)鍵的階段。甲狀腺激素是主要的生理性激素，同時(shí)也是調(diào)控腦發(fā)育的關(guān)鍵性激素。突觸是神經(jīng)元之間進(jìn)行信息交換的特殊部位和重要結(jié)構(gòu)，突觸數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化是突觸發(fā)育成熟的重要表現(xiàn)。煙堿受體是重要的神經(jīng)結(jié)構(gòu)之一，神經(jīng)元煙堿受體，包括腦nAChR和神經(jīng)節(jié)nAChR，主要分布于脊椎動(dòng)物腦、神經(jīng)節(jié)等部位。nAChR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有大量異源亞型存在，主要為 α4，β2 和 α4，α5，β2 亞型。外周神經(jīng)系統(tǒng)中則為 α3，β4 或 α3，β4，α5 亞型［9］。由于中樞nAChR亞單位的繁多，有可能形成多種不同組合的受體亞型。目前，現(xiàn)已證明在人、雞、鼠腦中最廣泛表達(dá)的異源性神經(jīng)元煙堿受體亞型為α4β2亞型(2個(gè)α4、3個(gè)β2亞單位組成)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元煙堿受體各亞型分布于突觸前和突觸后的不同部位，參與突觸信號(hào)的傳遞。Novere等［6］認(rèn)為在人中樞有α4－β2、α4－β4兩種受體亞型可能參與了認(rèn)知、神經(jīng)退行性變(如在帕金森病和AD中)、疼痛、焦慮與抑郁等過(guò)程。在腦發(fā)育過(guò)程中，普遍存在嬰兒時(shí)期nAChR的過(guò)早表達(dá)［10］，這些表明它們可能參與了神經(jīng)通路形成及維持［11］。近年大量的研究表明，nAChR在學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知行為中有重要的作用［4］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了nAChRα4 mRNA在生后30 d大腦皮層、海馬的動(dòng)態(tài)發(fā)育模式?？傮w趨勢(shì)為:在生后第0天表達(dá)很低，生后第14至21天 nAchRα4 mRNA表達(dá)達(dá)到高峰，以后隨著發(fā)育的成熟表達(dá)逐漸下降，直至成年鼠水平。大腦皮層Ⅲ和Ⅴ層中的錐體細(xì)胞在生后第14天表達(dá)了高峰值，海馬CA1區(qū)，原位雜交信號(hào)被限制在一些錐體細(xì)胞中。而來(lái)自海馬CA2、CA3區(qū)不是全部，大部分錐體細(xì)胞在生后第21天表達(dá)了高峰值。海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層中的原位雜交信號(hào)的表達(dá)在前3周基本趨于平穩(wěn)，于生后第14天達(dá)到高峰。以上說(shuō)明nAChRα4在CNS發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。Whiting等［12］在鳥(niǎo)腦的發(fā)育中也描述了 nAChRα4亞單位表達(dá)的變化模式。提出了nAChR受體激活可能調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物海馬錐體細(xì)胞突觸的形成。研究證明，nAChR表達(dá)的時(shí)相性在決定樹(shù)突結(jié)構(gòu)、構(gòu)型及調(diào)整錐體細(xì)胞神經(jīng)元活性方面起了關(guān)鍵的作用。另有研究表明［13］，中樞膽堿能神經(jīng)的發(fā)育及分布可以控制海馬區(qū)域 nAChRα4受體的表達(dá)，而且nAChRα4的時(shí)空表達(dá)影響了海馬錐體細(xì)胞突觸的發(fā)生以及相關(guān)神經(jīng)回路的建立。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到在生后第14－21天這個(gè)時(shí)期大腦皮層、海馬nAChRα4 mRNA表達(dá)水平達(dá)到高峰。而在同一時(shí)間內(nèi)Fiedler學(xué)者觀察到代表膽堿能神經(jīng)元發(fā)育的標(biāo)志酶乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶有一迅速的提高。另有實(shí)驗(yàn)表明，在生后第20至25天海馬DG和門(mén)區(qū)一些神經(jīng)元所包含的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶也體現(xiàn)一短暫迅速上升的模式。提示:nAChRα4 mRNA表達(dá)是緊隨著膽堿能神經(jīng)纖維分布的變化來(lái)調(diào)節(jié)的，也就是說(shuō)膽堿能神經(jīng)分布可能控制大腦皮層、海馬區(qū)域nAChRα4受體的表達(dá)。以前的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了膽堿能神經(jīng)元對(duì)腦發(fā)育關(guān)鍵期甲狀腺激素水平的改變十分敏感，甲狀腺激素可能直接或通過(guò)NGF及其受體trkA調(diào)節(jié)來(lái)影響中樞膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育。又一實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)鼠海馬nAChRα4受體內(nèi)源性激活可調(diào)節(jié)NGF的表達(dá)，而這些NGF是一個(gè)靶向營(yíng)養(yǎng)因子，能夠促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元存活、胞體發(fā)育和突起生長(zhǎng)［14］。

我們觀察到，甲減組nAChRα4表達(dá)的COD值均低于正常對(duì)照組，在甲減組無(wú)高峰延遲現(xiàn)象，而且兩組所表達(dá)的發(fā)育模式具有相同的時(shí)相性。nAChRα4光密度值減少，說(shuō)明體內(nèi)甲狀腺激素的減少影響了腦內(nèi)海馬區(qū)域 nAChRα4mRNA的生成。提示:①?zèng)]有出現(xiàn)高峰延遲現(xiàn)象，可能本身發(fā)育模式就是這樣;也有可能與實(shí)驗(yàn)本身所設(shè)定的時(shí)點(diǎn)有關(guān)，沒(méi)有包含延遲高峰的時(shí)點(diǎn)。②nAChRα4 mRNA的減少意味著位于突觸前膜nAChR調(diào)節(jié)大量神經(jīng)遞質(zhì)釋放及位于突觸后膜nAChR控制突觸傳遞的功能下降，同時(shí)也影響了皮層、海馬錐體細(xì)胞突觸的發(fā)生以及相關(guān)神經(jīng)回路的建立。

在本次實(shí)驗(yàn)中，采用原位雜交法檢測(cè)nAChRα4 mRNA表達(dá)，因nAChRα4基因編碼α4－1和α4－2兩種不同的產(chǎn)物，這兩種產(chǎn)物總是出現(xiàn)在相同的區(qū)域內(nèi)，且表達(dá)的強(qiáng)度基本相同(α4－1基因表達(dá)略高于α4－2基因表達(dá))。所以本次實(shí)驗(yàn)不能區(qū)分α4－1和α4－2基因表達(dá)，而且所標(biāo)記的探針對(duì)α4－1和α4－2基因序列都具有特異性。此外，是否這兩種產(chǎn)物都相同地涉及nAChR亞型的形成我們還不知道，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。甲狀腺激素對(duì)nAChRα4的生理調(diào)節(jié)不僅僅表現(xiàn)在數(shù)量的變化，很可能也存在有受體亞單位組合方式的改變?，F(xiàn)已知，在胚胎期大鼠神經(jīng)肌肉型nAChR是由(α1)2β1εδ五個(gè)亞單位組合，而出生后ε亞單位就轉(zhuǎn)變成為γ亞單位。中樞nAChR的亞單位繁多，它們是在胚胎期就已形成，隨著年齡的變化，受體亞單位是否也在不斷地重組，目前尚未完全清楚，這有待于實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)的進(jìn)一步提高。但在早老性癡呆病人腦組織中，已發(fā)現(xiàn)有nAChR基因突變的現(xiàn)象。

在突觸形成的關(guān)鍵期，甲狀腺激素水平的改變都會(huì)影響nAChRα4的表達(dá)，進(jìn)而影響了 nAChRα4亞單位功能的正常發(fā)揮，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞障礙，同時(shí)進(jìn)一步影響了海馬錐體細(xì)胞突觸的發(fā)生以及相關(guān)神經(jīng)回路的建立。即突觸形成障礙，出現(xiàn)了神經(jīng)元的曠置或錯(cuò)誤神經(jīng)通路，致使神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞障礙，阻礙了腦發(fā)育與功能成熟，這可能是甲狀腺激素水平異常造成腦整體突觸發(fā)育障礙的機(jī)制之一。

［1］ 李昭瑛.大鼠發(fā)育臨界期內(nèi)甲亢和甲減對(duì)中樞膽堿能神經(jīng)元發(fā)育的影響［J］.中華內(nèi)分泌雜志，1996，12(3):165 －167.

［2］ Tassonyi E，Meller D.The role of nicotinic acetylcholine receptors in the mechanisms of anesthesia［J］.Brain Res Bull，2002，57:133－150.

［3］ Hogg RC，Raggenbass M，Bertrand D.Nicotinic acetylcholine receptors:from structure to brain function［J］.Rev Physiol Biochem Pharmacol，2003，147:1 －46.

［4］ 劉振偉，劉傳貴.中樞神經(jīng)系統(tǒng)煙堿受體:性質(zhì)的多樣性，功能的未知性［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2001，32(2):149 －152.

［5］ Alkondon M，Albuquerque EX.The nicotinic acetylcholine receptor subtypes and their function in the hippocampus and cerebral cortex［J］.Prog Brain Res，2004，145:109 － 120.

［6］ Le Novere N，Changeux JP.Molecular evolution of the nicotinic acetylcholine receptor:an example of multigene family in excitable cells［J］.J Mol Evol，1995，40(2):155 －172.

［7］ Didier M，Bix G，Berman SA，et al.Expression of theα4 neuronal nicotinic acetylcholine receptors subunit in the developing mouse hippocampus［J］.Dev Neurosci，1995，13(7):705 －713.

［8］ Swanson LW.Brain maps:Structure of the rat brain［M］.Amsterdam:Elsevier Science Publishers BV，1992:50 －52.

［9］ Colquhoun LM，Patrick J W.Pharmacology of Neuronal nictonic acetylcholine receptors subtypes［J］.Adv Pharmacol，1997，39:191－220.

［10］ Martin Ruiz CM，Molnar E，Lee M，et al.α4 but not α3 and α7 nicotinic acetylcholine receptors subunits are lost from the temporal cortex in Alzheimer’s disease［J］.J Nerurochem，1999，73(4):1635－1640.

［11］ Pough PC，Berg DK.Neuronal acetylcholine receptors that bindαbungarotoxin mediate neurite retraction in a calcium-dependent manner［J］.J Neurosci，1994，14(2):889 － 895.

［12］ Whiting PJ，Schoepter R，Conroy WG，et al.Expression of nicotinic acetylcholine receptors subtypes in brain and retina［J］.Mol Brain Res，1991，10:61 －70.

［13］ Lloyd GK，Williams M.Neuronal nicotinic acetylcholine receptors as novel drug targets［J］.J Pharmacol Exp Ther，2000，292:461－467.

［14］ Oh JD，Butcher LL，Woolf NJ.Thyroid hormone modulates the development of Cholinergic terminal field in the rat forebrain:relation to nerve growth factor receptor［J］.Brain Res Dev Brain Res，1991，59:133 －142.