潤肺丸的質量標準研究

王增仙， 高蕭楓， 武敏霞， 李 平 (山西生物應用職業技術學院生物制藥工程系， 太原 030031)

潤肺丸是由連翹、麻黃、甘草、金銀花、當歸等藥材組成，具有潤肺解毒，祛痰止咳功效，是治療陰虛肺燥型肺結核的常用處方。甘草、金銀花有清熱解毒、止咳祛痰的功效，連翹有消腫散結功效，麻黃能發汗散寒、宣肺平喘。藥理實驗表明連翹除了有廣譜的抗菌作用外，還有顯著的解熱、抗炎、利尿、保護肝臟及鎮吐作用，現代研究表明其主要有效成分為連翹苷(C29H34O15)。原標準僅收錄了當歸的薄層色譜鑒別，標準極不完善。本文旨在通過增加專屬性強的薄層色譜鑒別及部分藥味的含量測定項，從而提高完善潤肺丸的質量標準。

1 儀器和試藥

依利特P200Ⅱ高效液相色譜儀。當歸對照藥材(120927－200613)，連翹對照藥材(120908－200411)，甘草次酸對照品(鑒別用，110723－200411)，鹽酸麻黃堿對照品(鑒別用，171242－200405)，綠原酸對照品(鑒別用，110753－200413)，連翹苷對照品(含量測定用，110821－200711)均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，水為純化水，其他所用試劑均為分析純。潤肺丸樣品(批號:20091101，20091102，20091103):實驗室自制。

2 薄層鑒別

2.1 當歸 取本品25 g，剪碎，加二氯甲烷120 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液濃縮至約1 ml，作為供試品溶液。另分別取當歸對照藥材和當歸藥材各1 g，同法制成對照藥材溶液和藥材溶液。取除當歸外的藥味，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法［1］(中國藥典2010年版一部 ⅥB)試驗，吸取上述供試品、對照藥材、藥材和陰性對照溶液4種溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－甲苯－乙酸乙酯(2∶1∶1)混合溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(見圖1)。

圖1 當歸薄層色譜圖Fig 1 Thin layer chromatogram of angelica

2.2 連翹 取本品35 g，剪碎，加甲醇60 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另分別取連翹對照藥材及連翹藥材各1 g，同法制成對照藥材溶液和藥材溶液。取除連翹外的藥味，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部ⅥB)試驗，吸取上述供試品、對照藥材、藥材、陰性對照溶液4種溶液各10 μl，分別點于同一以0.1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(40∶5∶10∶0.2)混合溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(見圖2)。

圖2 連翹薄層色譜圖Fig 2 Thin layer chromatogram of forsythia

2.3 甘草 取本品9 g，剪碎，加三氯甲烷60 ml，鹽酸6 ml，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液。另取甘草藥材1 g，同法制成藥材溶液。另取甘草次酸對照品，加無水乙醇制成2 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。取除甘草外的藥味，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部ⅥB)試驗，吸取上述供試品、藥材溶液、陰性對照溶液各 10 μl、對照品溶液 5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(30－60℃)－甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸(20∶40∶14∶1)混合溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(見圖3)。

圖3 甘草薄層色譜圖Fig 3 Thin layer chromatogram of licorice

2.4 麻黃 取本品9 g，研細，置50 ml錐形瓶中，加濃氨試液1 ml，乙醚30 ml，密塞，超聲處理30 min，濾過，加酸性乙醇(取乙醇20 ml，加鹽酸1 ml，混勻)1 ml，蒸干，殘渣加甲醇0.5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取麻黃藥材1 g，同法制成藥材溶液。另取鹽酸麻黃堿對照品，加甲醇制成5 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。取除麻黃外的藥味，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部 Ⅵ B)試驗，吸取上述供試品、藥材、陰性對照溶液各10 μl、對照品溶液2 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－濃氨試液(40∶10∶1)混合溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(見圖4)。

圖4 麻黃薄層色譜圖Fig 4 Thin layer chromatogram of ephedra

2.5 金銀花和山楂 取本品30 g，研細，加甲醇40 ml，搖勻，放置12 h，濾過，濾液作為供試品溶液。另分別取金銀花、山楂藥材各1 g，同法分別制成金銀花和山楂藥材溶液。另取綠原酸對照品，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。取除金銀花和山楂外的藥味，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部ⅥB)試驗，吸取上述供試品、藥材溶液、陰性對照溶液、對照品溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－水(10∶2∶3)的上層溶液混合溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點(見圖5)。

圖5 金銀花和山楂薄層色譜圖Fig 5 Thin layer chromatogram of honeysuckle and hawthorn

3 含量測定

3.1 色譜條件［2－5］色譜柱:Kromasil ODS C18(5 μm，150 mm ×4.6 mm)。檢測波長［1］:277 nm;流動相:乙腈 － 水21∶79，流速:1.0 ml/min。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取連翹苷對照品適量，加50%甲醇制成0.20 mg/ml的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，剪碎，取約9 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，浸漬過夜，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 ml，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g拌勻，加置即得中性氧化鋁柱(100－120目，1 g，內徑1 －1.5 cm)上用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至5 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方除連翹的全部藥味，按成品工藝及供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

3.3 系統適用性實驗 在上述色譜條件下，取供試品溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍，理論塔板數不低于3 000，主峰與其他雜質峰分離度大于1.5，符合要求。

3.4 專屬性實驗 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件檢測，在連翹苷保留時間處，陰性對照無其他成分干擾，結果表明，測定方法專屬性強，無干擾，結果見圖6。

圖6 連翹苷HPLC圖Fig 6 High performance liquid chromatogram of phillyrin

3.5 線性關系考察 精密稱取連翹苷對照品適量，加50%甲醇制成0.209 8 mg/ml的溶液，分別精密量取 1，2，3，3.5，4 ml至 10 ml量瓶中，用 50% 甲醇稀釋至刻度，分別進樣20 μl，測定。以連翹苷進樣量(μg)對峰面積繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程為 y=107.38+184.66x，r=0.999 9(n=5)。結果表明，連翹苷在0.419 6 －1.678 4 μg范圍內進樣量與峰面積之間呈良好線性關系。

3.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，重復進樣，連續測定5次，記錄峰面積，RSD值2.58%，表明精密度良好，符合含量測定要求。

3.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液(批號:20091101)，分別在制備后 0，2，6，12，24 h 后依法測定連翹苷的峰面積，結果連翹苷峰面積 RSD為0.98%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

3.8 回收率試驗 采用加樣回收方法，精密稱取已知含量的樣品(批號:20091101，0.355 1 mg/g)適量，分別加入一定量的連翹苷對照品，據3.2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定，結果表明:該法具有良好的回收率，見表1。

表1 回收率測定結果Tab 1 Results of recovery test

3.9 重復性試驗 取同批樣品(批號:20091101)，依法平行制備6份，分別測定連翹苷的含量，RSD值為1.04%，結果表明供試品制備方法重復性良好，符合含量測定要求。

3.10 樣品測定 精密吸取供試品溶液20 μl，按上述含量測定方法，分別對3批樣品進行測定，結果見表2。

表2 3批樣品中連翹苷的含量 (n=3)Tab 2 Content of phillyrin in samples (n=3)

參照3批樣品的含量測定結果，求得平均含量為3.210 3 mg/丸。以平均含量的80%作為樣品含量測定的限度，即本品含連翹以連翹苷(C29H36O15)計，每丸不得少于2.6 mg。

4 討論

4.1 本品中當歸、連翹、麻黃、甘草、金銀花、山楂等均為主要藥味，方法學研究結果表明，采用薄層色譜法對當歸、連翹、麻黃、甘草、金銀花、山楂等進行定性鑒別，薄層色譜斑點清晰、專屬性強。其中金銀花和山楂兩味藥存在干擾，選擇了雙陰性操作，在控制綠原酸的基礎上，結合藥材斑點，共同監控本品質量，在增加薄層鑒定藥味數量同時，一定程度加強質量控制的效力。在進行TLC鑒別研究時，增加了相應藥材的供試品溶液，以求保證本品質量的同時，監控投料藥材的質量，可作為一種中成藥TLC鑒別的一種思路，從源頭控制產品質量。

4.2 連翹苷為連翹的主要有效成分，參考有關文獻［3－5］，經研究對比，建立了連翹苷的含量測定法，經方法學驗證，本法重現性好、陰性對照無干擾，操作簡單，便于滿足工業化生產的需要，可有效控制本品的質量，為保證用藥的有效性提供技術支持。

4.3 色譜條件的選擇依據 本文先后考察了甲醇－水、乙腈－甲醇 －水、乙腈 －0.05%磷酸(19.5∶80.5)，最后采用乙腈－水(21∶79)作為流動相測定連翹苷的含量，檢測波長為277 nm，流速為1 ml/min。理論塔板數不低于3 000，主峰與其他雜質峰分離度大于 1.5，符合要求。

4.4 本文對未列入標準的其他藥味做了薄層鑒別方法學考察，鑒于本品由十八味藥材組成，干擾相對嚴重，按照傳統方法試圖鑒別其中的每一藥味比較困難，干擾多，工作量大，且不能充分利用每一種色譜條件下表現出的豐富信息。為此，下一步將嘗試采用“分組鑒別法”［6］，即按處方藥味所含成分的類別進行分組，合并同類項，針對大類成分的特點進行鑒別，以達到充分利用色譜信息，提高鑒別效率，體現復方整體特征的目的。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

［2］ 崔巖巖，馮少勇，趙光，等.連翹有效成分的HPLC法測定［J］.藥學學報，1992，21(1):120 －123.

［3］ 陸紅柳，潭喜瑩，張飛，等.HPLC法測定連翹苷的含量［J］.中草藥，1998，19(6):84 －85.

［4］ 何紹萍，陳華龍.高效液相色譜法測定小兒清解沖劑中連翹苷含量［J］.中國藥業，2011，20(3):21 －22.

［5］ 錢淑琴，陳宗良.HPLC法測定寧泌泰膠囊中連翹苷的含量［J］.中華中醫藥學刊，2011，29(3):208 －209.

［6］ 周躍華.中藥新藥質量標準研究中常見問題淺析［J］.中成藥，2004，26(11):972 －975.