小麥總RＮA的小量快速提取

摘要：以小麥幼苗的葉、莖和根組織為材料，采用ＣＴＡＢ法和尿素法分別提取其總ＲＮＡ。結(jié)果表明，ＣＴＡＢ法提取的總ＲＮＡ 經(jīng)電泳檢測，２８S ｒＲＮＡ和１８S ｒＲＮＡ帶型完整；Ａ２６０／Ａ２８０的比值接近２，純度較高；將提取的總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ，可用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。尿素法提取葉和莖組織的總ＲＮＡ質(zhì)量較好，但提取根組織的效果較差。說明ＣＴＡＢ法較適合小麥幼苗各組織總ＲＮＡ的提取。同時，兩種方法提取過程中均不使用液氮，可節(jié)約試驗成本。

關(guān)鍵詞：小麥；總ＲＮＡ；提取

中圖分類號：Ｓ５１２．１；Ｑ７８９文獻標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0463-03

Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓｍａｌｌ－ｓｃａｌｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｅａｔ

ＤＵ Ｈｅ－ｗｅｉ，ＳＵＮ Ｃｈｕａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｒｏｏｔｓ， ｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｂｙ ＣＴＡＢ ａｎｄ ｕｒｅａ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ｏｆ ２８S ｒＲＮＡ ａｎｄ １８S ｒＲＮＡ ｏｎ １％ （ｗ／ｖ） ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌｓ； ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ａ２６０／Ａ２８０ ａｐｐｒｏａｃｈｅｄ ２； ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ． Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｒｅａ ｍｅｔｈｏｄ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔｓ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｕｒｅａ ｍｅｔｈｏｄ． Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ， ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｗａｓ ｎｏｔ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，thus save the cost of experiments．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｅａｔ； ｔｏｔａｌ ＲＮＡ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ

高質(zhì)量ＲＮＡ的提取是分子生物學(xué)研究的重要一環(huán)，直接影響ｃＤＮＡ文庫的構(gòu)建、基因克隆以及表達分析等。小麥?zhǔn)侵匾霓r(nóng)作物，其ＲＮＡ提取方法較多［１－５］。盡管這些方法提取的ＲＮＡ質(zhì)量較好，但都要使用液氮，提高了試驗成本。本研究采用ＣＴＡＢ和尿素法分別提取小麥幼苗的根、莖和葉組織的總ＲＮＡ，為小麥總ＲＮＡ的提取提供了一條新途徑。

１ 材料與方法

１．１植物材料

小麥雜交品種鄭麥９０２３購于荊州市農(nóng)資大市場，播種于溫室，在苗期分別取根、莖和葉組織用于ＲＮＡ的提取。

１．２方法

１．２．１ＲＮＡ提取液成分ＣＴＡＢ法ＲＮＡ提取液成分：２０ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ，２０ ｇ／Ｌ ＰＶＰ，１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ值 ８．０），２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），２．０ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，混勻滅菌，用前每１００ ｍＬ提取液加入２ ｍＬ ２－巰基乙醇。

尿素法ＲＮＡ提取液成分：７ ｍｏｌ／Ｌ 尿素，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－HＣｌ（ｐＨ值８．０），１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），３．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１ ｇ／Ｌ ＳＤＳ。

１．２．２ＲＮａｓｅ滅活離心管和移液器吸頭用１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水浸泡２４ ｈ；研缽等用少量的無水乙醇灼燒，然后用錫箔紙包裝；Ｔｒｉｓ試劑用滅菌的１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水配制，其他試劑均用未滅菌的１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水配制；最后，將以上所有試劑或物品高壓滅菌４０ ｍｉｎ。

１．２．３尿素法提取ＲＮＡ步驟①取０．２ ｇ材料，加入研缽中，加入２ ｍＬ提取液，迅速充分研磨；②快速分裝到兩支１．５ ｍＬ的離心管中，于４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；③取上清液，加１／３體積的３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡc（ｐＨ值５．３），１／５體積的氯仿／異戊醇（２４∶１），混勻后冰浴２０ ｍｉｎ；④于４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；⑤取上清液加入等體積冰浴冷卻的異丙醇，冰浴１０ ｍｉｎ；⑥于４℃、５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；⑦沉淀溶于５ ｍＬ含有１ｇ／Ｌ ＳＤＳ的ＴＥ緩沖液中，加入８ ｍｏｌ/Ｌ ＬｉＣｌ至終濃度２．５ ｍｏｌ/Ｌ，冰浴３ ｈ；⑧于４℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；⑨７０％（Ｖ／Ｖ）乙醇洗滌沉淀兩次，空氣干燥后溶于ＤＥＰＣ處理水中，保存于－７０℃冰箱中備用。

１．２．４ＣＴＡＢ法提取ＲＮＡ步驟①將提取液置于６５℃水浴鍋中溫浴３０ ｍｉｎ，將研缽放在烘箱中低溫烘熱；②取０．２ ｇ材料于研缽中，加入２ ｍＬ提取液，迅速充分研磨，然后快速分裝到兩個１．５ ｍＬ離心管中，輕輕混勻，置于６５℃水浴鍋中１０ ｍｉｎ；③加入等體積的氯仿／異戊醇，混勻后在４℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ條件下離心１０ ｍｉｎ，吸取上清液；④重復(fù)上述步驟，并在合并的上清液中加入１／４體積的８ ｍｏｌ/Ｌ ＬｉＣｌ溶液并混勻，４℃過夜；⑤４℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，棄上清液；⑥加入５０ μＬ的滅菌ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，再加入１／１０ 體積的３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ和２倍體積的無水乙醇，于－７０℃放置３０ ｍｉｎ；⑦于４℃、

１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心 ２０ ｍｉｎ，棄上清液，用７０％（V/V）的乙醇清洗沉淀，吹干后加入３０ μＬ的滅菌ＤＥＰＣ水溶解，保存于－２０℃冰箱中備用。

１．２．５總ＲＮＡ完整性檢測

１） 瓊脂糖凝膠電泳檢測：電泳槽用１ ｍＬ／Ｌ ＤＥＰＣ水浸泡２４ ｈ，用１×ＭＯＰＳ作為電泳緩沖液。取２ μＬ ＲＮＡ溶液于１０ ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為９０Ｖ。

２）紫外分光光度計檢測：取４ μＬ ＲＮＡ溶液，用分光光度計測定Ａ２６０和Ａ２８０的值。每種組織取３份ＲＮＡ溶液樣品，求平均值。

３）ＲＴ－ＰＣＲ分析：使用Ｐｒｏｍega ｃＤＮＡ第一鏈合成試劑盒，合成ｃＤＮＡ第一鏈。反應(yīng)完成后，將合成產(chǎn)物稀釋５倍，取１ μＬ用于ＲＴ－ＰＣＲ的模板ｃＤＮＡ。根據(jù)小麥ａｃｔｉｎ基因（ＡＢ１８１９９１）設(shè)計１對引物，左引物為：５′ ＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴ ３′，右引物為：５′ ＴＴＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴ ３′。ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)體系為 ２５ μＬ：即１０×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ公司），２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ公司）２ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ公司）０．２ μＬ，各１ μＬ的雙向引物（０．１ μｍｏｌ/Ｌ），模板ｃＤＮＡ １ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １７．３ μＬ，最后滴１滴液體石蠟油。ＰＣＲ擴增程序為：９５℃ ３ ｍｉｎ；９５℃ １ ｍｉｎ，５７℃ １ ｍｉｎ，７２℃ １ ｍｉｎ（３５個循環(huán)）；７２℃ １０ ｍｉｎ； ４℃保存。

ＲＴ－ＰＣＲ擴增產(chǎn)物大小為２０８ ｂｐ，于１０ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠中，１２０Ｖ電泳４５ ｍｉｎ，然后于凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

２結(jié)果與分析

２．１ＲＮＡ完整性檢測

尿素法和ＣＴＡＢ法都能從小麥幼嫩的根、莖和葉組織中抽提出總ＲＮＡ，１８S ｒＲＮＡ和２８S ｒＲＮＡ條帶亮，帶型完整性較好，結(jié)果如下。從圖１分析得到，ＣＴＡＢ法從小麥幼葉、莖和根組織提取的總ＲＮＡ，帶型清晰，其中葉組織有５條帶型，說明葉綠體的總ＲＮＡ也被提取出來。從圖２可以看出，尿素法提取的總ＲＮＡ，葉和莖組織的質(zhì)量較好，根組織的ＲＮＡ降解比較嚴(yán)重，說明尿素法不適合用于提取小麥幼根組織的總ＲＮＡ。兩種方法的比較分析表明，ＣＴＡＢ法優(yōu)于尿素法，適合小麥幼葉、莖和根組織的ＲＮＡ提取。

２．２ＲＮＡ純度檢測

提取的ＲＮＡ經(jīng)分光光度計檢測表明，大多數(shù)ＲＮＡ純度較好，結(jié)果如表１。從表１可以看出，用ＣＴＡＢ法提取的小麥幼苗組織總ＲＮＡ，Ａ２６０／Ａ２８０的比值為１．９３8～２．００0，說明提取的ＲＮＡ純度較高，而且得率也較高。而使用尿素法提取小麥幼苗的葉和莖組織的總ＲＮＡ，Ａ２６０／Ａ２８０的比值介于１．９４8～１．９６2，說明提取的總ＲＮＡ純度較高，且得率也較高。但是用尿素法提取的小麥幼苗根的總ＲＮＡ，Ａ２６０／Ａ２８０比值為１．７10，說明ＲＮＡ純度較低，得率也較低。以上結(jié)果表明，ＣＴＡＢ法提取小麥幼苗各組織總ＲＮＡ的效果較好，尿素法適合提取小麥幼苗葉片和莖組織的總ＲＮＡ，不適合于小麥幼苗根組織總ＲＮＡ的提取。

２．３ＲＮＡ質(zhì)量檢測

為檢測ＣＴＡＢ法提取的ＲＮＡ質(zhì)量，分別將幼苗的莖、葉和根組織的總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ，并進行ＲＴ－ＰＣＲ擴增，結(jié)果如圖３。從圖３分析得到，ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)成功擴增出小麥的葉、莖和根組織中的ａｃｔｉｎ基因，說明ＣＴＡＢ法從小麥幼苗的葉、莖和根組織提取的ＲＮＡ質(zhì)量較好，能滿足ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)的要求。結(jié)果也暗示，使用ＣＴＡＢ法提取的小麥幼苗組織的ＲＮＡ，能滿足Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ、ｃＤＮＡ文庫構(gòu)建等后續(xù)研究的要求。ＣＴＡＢ法是小麥幼苗各組織ＲＮＡ提取的理想方法之一。

３討論

在ＲＮＡ提取過程中，材料的研磨應(yīng)經(jīng)常使用液氮而提高了試驗成本。本研究使用ＣＴＡＢ法和尿素法對小麥幼苗的根、莖和葉組織的ＲＮＡ進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＣＴＡＢ法提取效果好，適合小麥幼苗各組織ＲＮＡ的提取。同時在組織的研磨中，不使用液氮，直接將ＲＮＡ提取液和小麥幼苗組織混在一起研磨。提取的總ＲＮＡ質(zhì)量好、得率高，能滿足ＲＴ－ＰＣＲ等后續(xù)研究的要求。不過，本方法也有其局限性，對幼嫩組織的ＲＮＡ提取效果較好，而對成熟或衰老植物組織的提取效果較差；同時對保存在

－７０℃的植物組織，提取效果也較差。

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