家蠶微孢子蟲(Ｎosema bombycis)對蚯蚓的感染性試驗

摘要：為了進一步探索家蠶微孢子蟲的感染宿主范圍以及感染致病機制，試驗采用屬于原生動物環節動物門的動物—蚯蚓作為被感染對象，使用不同濃度的家蠶微孢子蟲對其進行感染試驗，觀察并統計蚯蚓的感染和死亡情況，并通過顯微鏡觀察蚯蚓體內微觀變化及微粒子孢子的變化情況。試驗結果表明，家蠶微孢子蟲對蚯蚓的感染能力較強，其半致死濃度ＬＣ５０為８．６×１０７個／ｍＬ。

關鍵詞：家蠶微孢子蟲；蚯蚓；感染

中圖分類號：Ｓ４７６．１；Ｓ８８４．２＋１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0538-03

Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｔｈｅ Ｉｎｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｔｏ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍ

ＬＩＵ Ｒｅｎ－ｈｕａ１，２，ＺＨＯＵ Ｄａ－ｘｉａｎｇ１，２，ＬＩ Ｙａｎ－ｊｉｅ１，２，ＹＡＮＧ Ｊｕｎ－ｎｉａｎ１，２，ＬＩＵ Ｙｕｎ－ｆｅｎｇ１，２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１００， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｗａｎｚｈｏｕ ４０４１００，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎs ｏｆ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｗere ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｏ ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ ｔｏ ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ waｓ ｓｔｒｏｎｇ， ｔｈｅ ｍｅｄｉａｎ ｌｅｔｈａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＬＣ５０） ｗａｓ ８．６×１０７ｐｉｅｃｅ／ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ； ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ

家蠶微孢子蟲（Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ） 被家蠶取食后可以引起家蠶疾病，直至死亡。最初被認為只能專性寄生于家蠶的單細胞真核生物。近代研究認為，家蠶微孢子蟲可廣泛寄生于動物，是經濟昆蟲、魚類、兔類、皮毛動物、嚙齒類及靈長類的致命病原。目前在分子水平上對宿主與寄生物間相互關系還知之甚少。本試驗采用屬于原生動物環節動物門的動物—蚯蚓作為被感染對象來進行感染性試驗，以求進一步探索家蠶微孢子蟲的感染宿主范圍以及感染致病機制。

１材料和方法

１．１試驗材料

１．１．１家蠶微孢子蟲家蠶微孢子蟲材料由西南大學生物技術學院家蠶病理實驗室惠贈，保存于重慶三峽學院生物系實驗室。通過飼養無病家蠶，用添食方法接種家蠶微孢子蟲入家蠶體內進行微孢子蟲的擴增，制成微孢子蟲原液，濃度為１０８個／ｍＬ。

１．１．２蚯蚓及飼料在魚餌店買回的大小均一的健康蚯蚓１５０條。蚯蚓是雜食性動物，各種禽糞、畜糞、瓜果皮、菜葉、樹葉以及無毒的生活垃圾等都可作為它的飼料。這些飼料先進行發酵，達到無臭味、無酸味、完全腐熟、外觀呈咖啡色后備用。

１．２試驗器材

雙目生物顯微鏡；冰箱；燒杯若干；研缽；載玻片、蓋玻片若干；玻璃杯；油瓶培養器；吸管；洗瓶；解剖器等。

１．３試驗方法

１．３．１微孢子蟲的提純將接種家蠶微粒子孢子后患病的五齡家蠶整體研磨，紗布過濾，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ粗提后，以差速離心法純化，調制為１０８個／ｍＬ的微孢子蟲孢子液［７］，放于４℃冰箱保存待用。

１．３．２微飽子蟲的添食

１）蚯蚓的飼養。用打有小孔的潔凈的自制油瓶培養器盛一層疏松肥沃土壤，將蚯蚓放入其中，加入已經發酵好的蚯蚓飼料，保持土壤濕潤，觀察蚯蚓生長狀況一周，無異常后，選擇生長健壯的蚯蚓１５０只待用。

２）微孢子蟲樣液濃度配制。對低溫保存的微孢子蟲溶液進行重懸，并進行活化，活化后使用紅血球計數板進行計數統計，用原樣濃度為１０８個／ｍＬ的微孢子液配制微孢子蟲稀釋液濃度為１０５、１０６、１０７個／ｍＬ各１０ｍＬ待用。

３）蚯蚓的分區飼養。按每種濃度設３個分區，另加一組空白對照，試驗共分１０個區，每個區分１５只蚯蚓，在相同的條件下飼養。

４）微孢子蟲的添食。向９個試驗區蚯蚓生活的土壤噴灑不同濃度的微孢子蟲溶液２ ｍＬ，每天觀察蚯蚓生活情況，統計蚯蚓感染和死亡情況。

１．３．３鏡檢每天統計死亡蚯蚓的條數，并觀察蚯蚓死亡后的外形變化，再將死亡的蚯蚓用研缽研碎，用無菌去離子水制成溶液后取少量于光學顯微鏡下觀察是否存在微孢子蟲。

１．３．４數據處理

死亡率計算，利用公式：

死亡率＝×１００％

對死亡率進行校正。校正死亡率計算利用公式：

Ｍ＝×１００％

其中：Ｍ為校正死亡率（％），ｃ為對照組死亡率（％），ｔ為處理組死亡率（％）。

在數據處理中，先對每個小組的試驗數據進行統計，再將沒有大偏差的數據進行數據混合，而后進行數據的統計分析。所有的數據分析均在ＥＸＣEＬ２００３中進行。最后得到對應的回歸方程、相關系數等。

半致死濃度ＬＣ５０的計算：試驗完畢后，清點各組死亡數并計算出死亡率（Ｐ），按改良寇氏法公式進行計算：

ＬＣ５０＝log－１［Ｘｍ-ｉ（∑Ｐ-０．５）］

其中：Ｘｍ為最大劑量的對數值；ｉ為相鄰兩組劑量對數值之差；Ｐ為各組動物死亡率，用小數表示（如死亡率為８０％應寫成０．８０）；∑Ｐ為各組動物死亡率之總和。

２結果與分析

２．１接種前期觀察結果

試飼養一周內蚯蚓生活均完全正常，未見異常情況。

２．２試驗數據記錄與數據處理結果

２．２．１數據處理不同濃度家蠶微孢子蟲添食蚯蚓后蚯蚓死亡率數據統計見表1。

通過表1可以看出：

１）試驗的前４ ｄ，蚯蚓死亡數逐漸增高。第五天開始各組蚯蚓死亡的總數趨于穩定，試驗組蚯蚓死亡的數量接近蚯蚓總數，對照組也有個別蚯蚓死亡，但死亡的數量明顯小于試驗組。其中濃度最高的試驗組的蚯蚓死亡的數量最多，而且死亡最快。

２）試驗組蚯蚓累計死亡率明顯高于對照組，試驗組中所選３種濃度梯度均與蚯蚓累計死亡率成正比例關系，濃度越高蚯蚓累計死亡率越高，而且死亡越快。

３）３種濃度的第四天的校正死亡率均高于７５．０％，其中濃度為１０７個／ｍＬ的最高接種濃度下的致死作用最強，第四天時平均死亡率為９１％，校正死亡率也達８９％。

２．２．２添食家蠶微孢子蟲后７ ｄ內蚯蚓的校正死亡率從圖１可以看出，蚯蚓在前４ｄ死亡最快，死亡率與天數成線性關系，在第四天開始校正死亡率趨于平穩。同時各濃度下的蚯蚓校正死亡率與濃度成正比例關系，即高濃度的其校正死亡率也高，低濃度的其校正死亡率也低。

２．２．３半致死濃度計算結果經計算，得到家蠶微孢子蟲對蚯蚓的半致死濃度ＬＣ５０＝８．６×１０７個／ｍＬ。

３討論

此試驗結果表明，一定濃度的家蠶微孢子蟲能夠引起環節動物門的蚯蚓感染并致其死亡。而且家蠶微孢子蟲對蚯蚓的感染作用時間較短，在短期內具有較強的致死作用。后續的鏡檢分析表明家蠶微孢子蟲在蚯蚓體內的感染率也較高。雖然在１０７個／ｍＬ的接種濃度下致死作用較好，然而最適添食濃度的選擇尚需進一步的試驗摸索。

本試驗中，蚯蚓在添食家蠶微孢子蟲后明顯表現出活動緩慢，挑起時卷曲程度不大，形態成癱軟狀，在觀察的后期腸腔內泥沙少等現象，這是與蚯蚓的取食量有關，說明蚯蚓消化能力減弱，微孢子蟲感染了蚯蚓的消化系統。觀察死亡蚯蚓的形態，發現有的蚯蚓全身出現痙攣狀的結節，體色變白，體壁破裂或體節斷裂，這種現象說明蚯蚓是因不良環境條件的影響而造成的死亡。對照組的飼料由于后期部分酸化后被蚯蚓取食酸性食物而致胃酸過多導致部分死亡，這是對照組蚯蚓死亡的主要原因。

本試驗的蚯蚓體內微孢子蟲孢子檢測說明一定濃度的家蠶微孢子蟲對環節動物門的蚯蚓有一定的感染和致死能力。本試驗結果為后期探索家蠶微孢子蟲的病蟲傳播提供了可能性說明。

在以往報道的研究中家蠶微孢子蟲不僅能感染家蠶，還能感染草地貪夜蛾卵巢細胞、小菜蛾、菜青蟲、野生型及突變型果蠅等，這些都是變態型生長發育的昆蟲。本試驗證實了家蠶微孢子蟲能夠跨門感染環節動物類的蚯蚓，甚至致其死亡。本次試驗為后期研究家蠶微孢子蟲的感染宿主范圍和感染機制提供了一定參考。

參考文獻：

［１］ 陳廣文，陳曲候． 甜菜夜蛾微孢子蟲研究．超微結構與致病機理［Ｊ］． 動物學報，１９９９，４５（２）：１２１－１２８．

［２］ 冀煒，顧新全．赤眼蜂防治菜粉蝶研究［Ｊ］．西北農業學報，１９９６，５（３）：６５－６８．

［３］ 孫勝，宗浩， 楊小蓉． 家蠶微孢子（Ｎｏｓｅｍａ ｂｏｍｂｙｃｉｓ）對菜青蟲（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ）的感染與致病性研究［Ｊ］． 四川師范大學學報（自然科學版），２００１，２４（１）：６９－７１．

［４］ 張志芳，沈中元．微孢子蟲研究進展［Ｊ］．蠶業科學，２０００， ２６（１）：３９－４１．

［５］ 貢成良，早坂昭二．微孢子蟲的發芽及對細胞的感染性［Ｊ］．蠶業科學，１９９９，２５（４）：６－１１．

［６］ 喬淑麗．針對蚯蚓習性選擇養殖方法［N］．湖南科技報（養殖天地），２０００（２）．

［７］ 張德貴．蚯蚓病害須防治［Ｊ］．漁業致富指南，２００２（３）：４８．

［８］ 萬永繼，劉仁華，沈佐銳． 寄生于龍眼裳卷蛾的微孢子蟲一新種（微孢子蟲門，布雷孢蟲科）［Ｊ］．動物分類學報，２００５（２）：２９１－２９４．

［９］ 劉仁華，萬永繼，劉強波，等．裳卷蛾變形孢蟲（Ｖａｉｒｉｍｏｒｐｈａ ｃｅｒａｃｅｓ ｓｐ．ｎｏｖ）對家蠶、魚類的感染性試驗［Ｊ］．蠶業科學，２００６（１）：５８－６１．

［１０］ 劉仁華． 龍眼卷葉蛾（Ｃｅｒａｃｅ Ｓｔｉｐａｔａｎａ Ｗａｌｋｅｒ）微孢子蟲的生物學分類及相關感染性問題的研究［Ｄ］．西南農業大學碩士學位論文，２００４.