玻璃化超低溫保存對懷菊花再生苗形態及生理的影響

摘要：以懷菊花中的優良品種小黃菊為試材，研究了玻璃化超低溫保存對懷菊花再生苗形態及生理指標的影響。結果表明，與常溫苗相比，繼代培養的玻璃化超低溫保存再生苗前期（０～１５ ｄ）生長較慢，中期（１５～３０ ｄ）開始快速生長，至４５ ｄ時，二者長勢基本一致；葉片的可溶性糖、可溶性蛋白質和葉綠素含量均沒有顯著的差異。玻璃化超低溫保存能夠保持其形態和生理的穩定性。

關鍵詞：懷菊花；超低溫保存；再生苗；形態；生理指標

中圖分類號：Ｓ３２５．１＋２；Ｓ６８２．１＋１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）03－0533-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕａｉｑｉｎｇ Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ （Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ） Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｌａｎｔｌｅｔｓ

ＺＨＡＯ Ｘｉ－ｔｉｎｇ１，２，ＳＯＮＧ Ｐｉｎｇ－ｐｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｍｉａｏ１，ＺＨＡＯ Ｙｕｅ－ｌｉ１，ＧＵＯ Ｊｉｎｇ１，ＬＩ Ｍｉｎｇ－ｊｕｎ１，２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００７，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｎｕｒｓｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｕｉｎｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｒｕｄｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００７，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ， Ｘｉａｏｈｕａｎｇｊｕ， ａ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）， ｗａｓ taken ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， to study the eｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕａｉｑｉｎｇ Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒing ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒｅｗ ｓｌｏｗｌｙ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ （０～１５ ｄ）； ａｎｄ ｔｈｅｎ began ｔｏ ｇｒｏｗ ｆａｓｔer ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｔｅｒｍ （１５～３０ ｄ）； till the 45th day， ｔｈｅｙ ｓｅｅｍｅｄ ｃｏｎｇｒｕｏｕｓｌｙ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ. Tｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ increasing ｖａｌｕｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎｏｄａｌ ｌｅｎｇｔｈ， ｐｌａｎｔ ｈｅｉｇｈｔ， ｌｅａｆ ｎｕｍｂｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ， ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ． Thus ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｖｉａ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）；ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎｄｅｘ

懷菊花［Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ （Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）］是“四大懷藥”之一，有很高的藥用價值，《中國藥典》２０００年版記載：菊，甘苦，微寒；歸肺、肝經；具有散風清熱、平肝明目之功效［１］。但目前懷菊花種質資源仍采用大田種植保存的方式，這種方式易遭受病蟲害的侵襲和極端環境的威脅，長期以來種質混雜，品種流失嚴重。超低溫保存（Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）是目前植物種質資源長期穩定保存的最好方法［２］，自１９７３年Ｎａｇ和Ｓｔｒｅｅｔ首次在液氮中成功保存胡蘿卜懸浮細胞以來，超低溫保存技術已取得了突破性進展，許多植物材料如原生質體［３］、愈傷組織［４］、體細胞胚［５］、莖尖分生組織［６－１０］、芽［１１－１４］、花粉［１５，１６］等植物組織和器官采用超低溫保存都已取得成功［１７］，并且，大部分已實現植株再生。近年來，菊花的超低溫保存在國外已有報道［７，１８］，但是對其超低溫保存后再生植株形態及生理方面的研究鮮見報道［５，６］。自２００６年以來，我們以懷菊花中優良品種小黃菊為試材，開展了玻璃化超低溫保存懷菊花種質的研究，已成功建立了懷菊花的玻璃化超低溫保存技術體系，在此基礎上，從形態、生理、同工酶和ＤＮＡ等水平上對建立的體系進行了可行性研究，該文是報道形態和生理方面的內容。

１材料與方法

１．１材料

河南師范大學生命科學學院“四大懷藥”組織培養研究室繼代培養的小黃菊［Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ） ｃｖ． Ｘｉａｏｈｕａｎｇｊｕ］試管苗（ＣＫ）和經過玻璃化超低溫保存的繼代培養２次的小黃菊再生苗（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＲＰＣ）。

１．２方法

１．２．１玻璃化超低溫保存的小黃菊再生苗的獲得將繼代培養一定時間的試管苗低溫鍛煉幾天后，在無菌條件下切取１ ｃｍ左右的帶芽莖段，放入含有一定蔗糖濃度的ＭＳ基本培養基中于４℃下預培養３ ｄ，然后將材料切成２ ｍｍ左右的帶芽莖段，室溫下用裝載液裝載２０ ｍｉｎ之后，加入玻璃化溶液（Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｏｆ ｖｉｔｒｉｆｉａｂｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＶＳ），并置于０℃下脫水６０ ｍｉｎ，迅速投入液氮保存；在液氮中保存１ ｄ后，立即放入溫水浴中快速化凍３ ｍｉｎ，化凍后用ＭＳ液體培養基洗滌２次，最后轉入再生培養基中，先于暗處培養，再轉到光下培養，可獲得超低溫保存后的再生苗。將獲得的再生苗進行２次繼代培養，并進行形態學觀測，培養至４５ ｄ時進行相關生理指標的測定。

１．２．２形態學觀測將經過玻璃化超低溫保存后的小黃菊再生苗與繼代培養的常溫苗切取２～３ ｃｍ左右的莖段接種到再生培養基上，２５℃光下培養。分別對光下培養０、１５、３０、４５ ｄ的再生苗和常溫苗進行形態學觀察，并定期測量莖節長、株高和葉片數。平均莖節長（株高／葉片數）增加值＝觀測當天的平均莖節長（株高／葉片數）－０ ｄ的平均莖節長（株高／葉片數）。單株試管苗為樣本，１０次重復。

１．２．３生理指標測定對光下培養４５ ｄ的超低溫保存后再生苗和常溫苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白質和葉綠素含量進行測定。可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法［１９］，可溶性蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法［１９，２０］，葉綠素含量測定采用Ａｒｎｏｎ法［２１］。

１．２．４數據處理及分析方法采用配對樣本ｔ測驗方法。

２結果與分析

２．１玻璃化超低溫保存對懷菊花再生苗形態的影響

如圖１和圖２所示，與常溫苗相比，再生苗在繼代培養的前期（０～１５ ｄ）生長較慢，中期（１５～３０ ｄ）開始快速生長，之后，二者生長速度相當，至４５ ｄ時，長勢基本一致；且各時期二者的平均莖節長、株高和葉片數增加值均沒有顯著差異。

２．２玻璃化超低溫保存對懷菊花再生苗葉片一些生理指標的影響

２．２．１玻璃化超低溫保存對懷菊花再生苗可溶性糖和可溶性蛋白質含量的影響由表1可以看出， 懷菊花經過玻璃化超低溫保存后的再生苗葉片中可溶性糖含量比常溫苗略高，可溶性蛋白質含量和常溫苗基本一致。經方差分析兩者均沒有顯著差異，說明玻璃化超低溫保存沒有改變懷菊花葉片的可溶性糖和可溶性蛋白質含量。

葉片的葉綠素ａ、葉綠素ｂ、總葉綠素含量均比常溫苗略高，但差異沒有達到顯著性水平。說明玻璃化超低溫保存沒有改變懷菊花葉片的葉綠素含量。

３討論

超低溫保存是指在超低溫條件（一般指液氮低溫－１９６℃）下保存種質的技術，通常稱為液氮保存，是目前惟一可行的、在保存過程中不需繼代就可以實現植物種質資源長期保存的理想方法。在液氮條件下，幾乎所有的細胞代謝活動和生長過程都停止進行，而細胞活力和形態發生的潛能可保存，這樣植物材料處于相對穩定的生物學狀態，從而可以達到長期保存種質的目的［１１］。

玻璃化超低溫保存是將細胞或組織在冰凍前，用植物玻璃化溶液處理使細胞在－１９６℃下不形成冰晶而呈玻璃化狀態。該方法具有需要設備簡單、操作方便、重復性好等特點，為種質資源的保存提供了更為理想的途徑。

研究表明，玻璃化超低溫保存后，再生的植株能很好地保持其遺傳穩定性。玻璃化超低溫保存后木瓜再生植株在形態上，無論是葉柄的顏色、葉子的形狀、雌花的大小和顏色以及果實的形狀和色澤均沒有差異［２２］；與對照相比，玻璃化超低溫保存后蘋果莖尖的再生苗不僅在形態上沒有發生變異，同時其葉片中可溶性蛋白質含量、基因水平均沒有發生變異［２３］； Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ玻璃化超低溫保存后無論是形態水平（成熟葉片長寬比、新生芽數、節間長度等）、分子水平，還是次生代謝產物含量（薯蕷皂甙元）等方面均保持穩定［２４］。本研究也顯示，玻璃化超低溫保存后的懷菊花再生苗在形態上沒有變異，同時葉片中可溶性糖、可溶性蛋白質和葉綠素含量也沒有發生變異，在形態和生理上保持了其穩定性，至于在基因水平上是否發生變異還有待進一步研究。

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