玻璃化超低溫保存對(duì)懷菊花再生苗形態(tài)及生理的影響

摘要：以懷菊花中的優(yōu)良品種小黃菊為試材，研究了玻璃化超低溫保存對(duì)懷菊花再生苗形態(tài)及生理指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，與常溫苗相比，繼代培養(yǎng)的玻璃化超低溫保存再生苗前期（０～１５ ｄ）生長(zhǎng)較慢，中期（１５～３０ ｄ）開(kāi)始快速生長(zhǎng)，至４５ ｄ時(shí)，二者長(zhǎng)勢(shì)基本一致；葉片的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量均沒(méi)有顯著的差異。玻璃化超低溫保存能夠保持其形態(tài)和生理的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：懷菊花；超低溫保存；再生苗；形態(tài)；生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)：Ｓ３２５．１＋２；Ｓ６８２．１＋１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０11）03－0533-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕａｉｑｉｎｇ Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ （Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ） Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐｌａｎｔｌｅｔｓ

ＺＨＡＯ Ｘｉ－ｔｉｎｇ１，２，ＳＯＮＧ Ｐｉｎｇ－ｐｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｍｉａｏ１，ＺＨＡＯ Ｙｕｅ－ｌｉ１，ＧＵＯ Ｊｉｎｇ１，ＬＩ Ｍｉｎｇ－ｊｕｎ１，２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００７，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｎｕｒｓｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｕｉｎｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｒｕｄｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００７，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ， Ｘｉａｏｈｕａｎｇｊｕ， ａ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）， ｗａｓ taken ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， to study the eｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｈｕａｉｑｉｎｇ Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒing ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｇｒｅｗ ｓｌｏｗｌｙ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ （０～１５ ｄ）； ａｎｄ ｔｈｅｎ began ｔｏ ｇｒｏｗ ｆａｓｔer ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｔｅｒｍ （１５～３０ ｄ）； till the 45th day， ｔｈｅｙ ｓｅｅｍｅｄ ｃｏｎｇｒｕｏｕｓｌｙ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ. Tｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ increasing ｖａｌｕｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎｏｄａｌ ｌｅｎｇｔｈ， ｐｌａｎｔ ｈｅｉｇｈｔ， ｌｅａｆ ｎｕｍｂｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ， ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ． Thus ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｖｉａ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）；ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎｄｅｘ

懷菊花［Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ （Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）］是“四大懷藥”之一，有很高的藥用價(jià)值，《中國(guó)藥典》２０００年版記載：菊，甘苦，微寒；歸肺、肝經(jīng)；具有散風(fēng)清熱、平肝明目之功效［１］。但目前懷菊花種質(zhì)資源仍采用大田種植保存的方式，這種方式易遭受病蟲(chóng)害的侵襲和極端環(huán)境的威脅，長(zhǎng)期以來(lái)種質(zhì)混雜，品種流失嚴(yán)重。超低溫保存（Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）是目前植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的最好方法［２］，自１９７３年Ｎａｇ和Ｓｔｒｅｅｔ首次在液氮中成功保存胡蘿卜懸浮細(xì)胞以來(lái)，超低溫保存技術(shù)已取得了突破性進(jìn)展，許多植物材料如原生質(zhì)體［３］、愈傷組織［４］、體細(xì)胞胚［５］、莖尖分生組織［６－１０］、芽［１１－１４］、花粉［１５，１６］等植物組織和器官采用超低溫保存都已取得成功［１７］，并且，大部分已實(shí)現(xiàn)植株再生。近年來(lái)，菊花的超低溫保存在國(guó)外已有報(bào)道［７，１８］，但是對(duì)其超低溫保存后再生植株形態(tài)及生理方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道［５，６］。自２００６年以來(lái)，我們以懷菊花中優(yōu)良品種小黃菊為試材，開(kāi)展了玻璃化超低溫保存懷菊花種質(zhì)的研究，已成功建立了懷菊花的玻璃化超低溫保存技術(shù)體系，在此基礎(chǔ)上，從形態(tài)、生理、同工酶和ＤＮＡ等水平上對(duì)建立的體系進(jìn)行了可行性研究，該文是報(bào)道形態(tài)和生理方面的內(nèi)容。

１材料與方法

１．１材料

河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院“四大懷藥”組織培養(yǎng)研究室繼代培養(yǎng)的小黃菊［Ｈｕａｉｑｉｎｇ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ） ｃｖ． Ｘｉａｏｈｕａｎｇｊｕ］試管苗（ＣＫ）和經(jīng)過(guò)玻璃化超低溫保存的繼代培養(yǎng)２次的小黃菊再生苗（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔｌｅｔ ａｆｔｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ＲＰＣ）。

１．２方法

１．２．１玻璃化超低溫保存的小黃菊再生苗的獲得將繼代培養(yǎng)一定時(shí)間的試管苗低溫鍛煉幾天后，在無(wú)菌條件下切?。?ｃｍ左右的帶芽莖段，放入含有一定蔗糖濃度的ＭＳ基本培養(yǎng)基中于４℃下預(yù)培養(yǎng)３ ｄ，然后將材料切成２ ｍｍ左右的帶芽莖段，室溫下用裝載液裝載２０ ｍｉｎ之后，加入玻璃化溶液（Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ｏｆ ｖｉｔｒｉｆｉａｂｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＶＳ），并置于０℃下脫水６０ ｍｉｎ，迅速投入液氮保存；在液氮中保存１ ｄ后，立即放入溫水浴中快速化凍３ ｍｉｎ，化凍后用ＭＳ液體培養(yǎng)基洗滌２次，最后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基中，先于暗處培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，可獲得超低溫保存后的再生苗。將獲得的再生苗進(jìn)行２次繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)，培養(yǎng)至４５ ｄ時(shí)進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。

１．２．２形態(tài)學(xué)觀測(cè)將經(jīng)過(guò)玻璃化超低溫保存后的小黃菊再生苗與繼代培養(yǎng)的常溫苗切取２～３ ｃｍ左右的莖段接種到再生培養(yǎng)基上，２５℃光下培養(yǎng)。分別對(duì)光下培養(yǎng)０、１５、３０、４５ ｄ的再生苗和常溫苗進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并定期測(cè)量莖節(jié)長(zhǎng)、株高和葉片數(shù)。平均莖節(jié)長(zhǎng)（株高／葉片數(shù)）增加值＝觀測(cè)當(dāng)天的平均莖節(jié)長(zhǎng)（株高／葉片數(shù)）－０ ｄ的平均莖節(jié)長(zhǎng)（株高／葉片數(shù)）。單株試管苗為樣本，１０次重復(fù)。

１．２．３生理指標(biāo)測(cè)定對(duì)光下培養(yǎng)４５ ｄ的超低溫保存后再生苗和常溫苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定。可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法［１９］，可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法［１９，２０］，葉綠素含量測(cè)定采用Ａｒｎｏｎ法［２１］。

１．２．４數(shù)據(jù)處理及分析方法采用配對(duì)樣本ｔ測(cè)驗(yàn)方法。

２結(jié)果與分析

２．１玻璃化超低溫保存對(duì)懷菊花再生苗形態(tài)的影響

如圖１和圖２所示，與常溫苗相比，再生苗在繼代培養(yǎng)的前期（０～１５ ｄ）生長(zhǎng)較慢，中期（１５～３０ ｄ）開(kāi)始快速生長(zhǎng)，之后，二者生長(zhǎng)速度相當(dāng)，至４５ ｄ時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)基本一致；且各時(shí)期二者的平均莖節(jié)長(zhǎng)、株高和葉片數(shù)增加值均沒(méi)有顯著差異。

２．２玻璃化超低溫保存對(duì)懷菊花再生苗葉片一些生理指標(biāo)的影響

２．２．１玻璃化超低溫保存對(duì)懷菊花再生苗可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響由表1可以看出， 懷菊花經(jīng)過(guò)玻璃化超低溫保存后的再生苗葉片中可溶性糖含量比常溫苗略高，可溶性蛋白質(zhì)含量和常溫苗基本一致。經(jīng)方差分析兩者均沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明玻璃化超低溫保存沒(méi)有改變懷菊花葉片的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量。

葉片的葉綠素ａ、葉綠素ｂ、總?cè)~綠素含量均比常溫苗略高，但差異沒(méi)有達(dá)到顯著性水平。說(shuō)明玻璃化超低溫保存沒(méi)有改變懷菊花葉片的葉綠素含量。

３討論

超低溫保存是指在超低溫條件（一般指液氮低溫－１９６℃）下保存種質(zhì)的技術(shù)，通常稱為液氮保存，是目前惟一可行的、在保存過(guò)程中不需繼代就可以實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的理想方法。在液氮條件下，幾乎所有的細(xì)胞代謝活動(dòng)和生長(zhǎng)過(guò)程都停止進(jìn)行，而細(xì)胞活力和形態(tài)發(fā)生的潛能可保存，這樣植物材料處于相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)狀態(tài)，從而可以達(dá)到長(zhǎng)期保存種質(zhì)的目的［１１］。

玻璃化超低溫保存是將細(xì)胞或組織在冰凍前，用植物玻璃化溶液處理使細(xì)胞在－１９６℃下不形成冰晶而呈玻璃化狀態(tài)。該方法具有需要設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，為種質(zhì)資源的保存提供了更為理想的途徑。

研究表明，玻璃化超低溫保存后，再生的植株能很好地保持其遺傳穩(wěn)定性。玻璃化超低溫保存后木瓜再生植株在形態(tài)上，無(wú)論是葉柄的顏色、葉子的形狀、雌花的大小和顏色以及果實(shí)的形狀和色澤均沒(méi)有差異［２２］；與對(duì)照相比，玻璃化超低溫保存后蘋(píng)果莖尖的再生苗不僅在形態(tài)上沒(méi)有發(fā)生變異，同時(shí)其葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量、基因水平均沒(méi)有發(fā)生變異［２３］； Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ玻璃化超低溫保存后無(wú)論是形態(tài)水平（成熟葉片長(zhǎng)寬比、新生芽數(shù)、節(jié)間長(zhǎng)度等）、分子水平，還是次生代謝產(chǎn)物含量（薯蕷皂甙元）等方面均保持穩(wěn)定［２４］。本研究也顯示，玻璃化超低溫保存后的懷菊花再生苗在形態(tài)上沒(méi)有變異，同時(shí)葉片中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量也沒(méi)有發(fā)生變異，在形態(tài)和生理上保持了其穩(wěn)定性，至于在基因水平上是否發(fā)生變異還有待進(jìn)一步研究。

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