油菜莖基潰瘍病菌基因組DＮA提取方法的比較

摘要：比較了油菜莖基潰瘍病菌基因組ＤＮＡ的尿素提取法、ＳＤＳ－ＣＴＡＢ提取法、ＣＴＡＢ提取法和試劑盒提取法的提取過程、ＤＮＡ純度和對ＰＣＲ擴增的影響，旨在篩選能替代昂貴試劑盒法的方法。結果表明，尿素提取法可以滿足ＤＮＡ的ＰＣＲ擴增要求，并取得與試劑盒提取法相似的效果。尿素提取法還具有操作簡便、成本低廉等優點，在植物檢驗檢疫中具有潛在的應用價值。

關鍵詞：油菜莖基潰瘍病菌；ＰＣＲ；基因組ＤＮＡ；提取方法

中圖分類法：Ｓ４３５．６５４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0511-03

Ｃｏｍｐａｒisｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ

ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｈｕａ，ＺＨＡＯ Ｈｕｉ，ＳＯＮＧ Ｑｉ，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｘｉｎ，ＦＥＮＧ Ｈａｎ－ｌｉ，ＹＡＮＧ Ｗｕ，ＹＵ Ｈａｏ，ＷＡＮＧ Ｈａｎ－ｃｈａｎｇ

（Ｈｕｂｅｉ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｗｕｈａｎ ４３００５０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｓ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ， ａｎｄ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｂｙ the Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｏｎ ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｐｌａｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ， the ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， ＤＮＡ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ（Uｒｅａ， ＳＤＳ－ＣＴＡＢ， ＣＴＡＢ ａｎｄ ｋｉｔ）ｗｅre ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Uｒｅａ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ of ＤＮＡ ＰＣＲ， ａｎｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａ ｓｉｍｉｌａｒ ｅｆｆｅｃｔ ｔｏ ｔｈｅ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ． Ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｏｓｔ， ｔｈｅ Ｕｒｅａ ｍｅｔｈｏｄ ｗｏｕｌｄ ｈａｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ； ＰＣＲ； ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ

近幾年來，進口油菜子呈大幅增長趨勢，據國家糧油信息中心統計，僅２００９年進口油菜子就達２０２萬ｔ。與此同時，口岸截獲包括油菜莖基潰瘍病菌在內的有害生物種類和數目也在大幅增加。油菜莖基潰瘍病菌（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）屬于小球腔菌屬（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ），主要為害油菜與其他十字花科作物，在油菜莖、葉形成灰色斑點，莖基部形成凹陷的潰瘍斑，上有黑色小點；嚴重時，根部和種莢也受到侵染，種子帶菌［１］。２００７年被列為我國對外公布的進境植物檢疫性有害生物。

目前，基因組ＤＮＡ的ＰＣＲ擴增是油菜莖基潰瘍病菌的常規檢測手段，而試劑盒提取法是我國檢驗檢疫系統提取基因組ＤＮＡ的主要方法，但試劑盒價格高且常常出現供貨短缺而延長檢測周期等問題。為了降低實驗成本，加快油菜子在口岸的通關速度，我們比較了幾種油菜莖基潰瘍病菌ＤＮＡ的提取方法，發現簡便有效的尿素提取法可以滿足該病菌基因組ＤＮＡ的ＰＣＲ擴增要求。

１材料與方法

１．１菌株及其培養

油菜莖基潰瘍病致病菌菌株為湖北出入境檢驗檢疫局從加拿大進口油菜子中分離，經過形態學觀察和強毒株系特異性的、長為５８０ ｂｐ 的ＤＮＡ測序鑒定，并被華中農業大學李國慶教授鑒定為油菜莖基潰瘍病菌。

純化的分離物接種在ＰＤＡ培養基上，２０℃黑暗條件培養１周，挑取少量菌絲用于ＤＮＡ提取實驗。

１．２ＤＮＡ提取

１．２．１尿素提取法［２］取５００ μＬ尿素提取液（７ ｍｏｌ／Ｌ脲、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣl ｐＨ ８．０、６２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣl、１％ ＳＤＳ）與１０ μＬ ２０ ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ至ＥＰ管中，挑取２００ ｍｇ菌絲至ＥＰ管，混勻。５５℃溫育３０ ｍｉｎ，每隔１０ ｍｉｎ振蕩混勻１次，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，將上清液移入另一ＥＰ管中，加入等體積的苯酚－氯仿－異戊醇（體積比為２５：２４：１）溶液，顛倒混勻，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；再取上清到另一ＥＰ管中加入等體積的異丙醇和１／１０體積的３ ｍｏｌ／Ｌ 醋酸鈉（ｐＨ ５．２），－２０℃ 放置２０ ｍｉｎ，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；棄上清液，倒置晾干，用７０％乙醇洗滌，室溫倒置于吸水紙上晾干，溶于２０ μＬ ＴＥ溶液中，加入ＲＮａｓｅ Ａ （１ μｇ／μＬ） １ μＬ，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，３７℃水浴３０ ｍｉｎ，－２０℃保存備用。實驗重復３次。

１．２．２ＣＴＡＢ提取法［２，３］取５００ μＬ ＣＴＡＢ提取液［（0.1 ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣl（ｐＨ ８．０）、１％ ＣＴＡＢ、０．７ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣl、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴA）］與５ μＬ ２－巰基乙醇至ＥＰ管中，挑取２００ ｍｇ菌絲至ＥＰ管，混勻。６５℃ 水浴１ ｈ，每隔１０ ｍｉｎ振蕩混勻１次，冷卻至室溫，加入３００ μＬ苯酚與３００ μＬ 氯仿－異戊醇（體積比為２４∶１），顛倒混勻。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，取上清液于另一ＥＰ管中，加入等體積的氯仿－異戊醇（體積比為２４∶１），顛倒混勻數次，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ；取上清液于另一ＥＰ管中，加入０．８倍體積的異丙醇，１／１０體積３ｍｏｌ／Ｌ醋酸鈉溶液，顛倒混勻，于－２０℃靜置１ｈ。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄去上清液，用７０％乙醇洗滌，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，倒置于吸水紙上室溫晾干。加２０ μＬ ＴＥ溶液溶解，－２０℃保存備用。實驗重復３次。

１．２．３ＳＤＳ－ＣＴＡＢ提取法［２，３］取５００μＬ ＣＴＡＢ提取液［（０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣl（ｐＨ ８．０）、１％ ＣＴＡＢ、０．７ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣl、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）］與１００ μＬ １０％ ＳＤＳ溶液至ＥＰ管中，挑取２００ ｍｇ菌絲至ＥＰ管中，混勻。６５℃ 水浴１ ｈ，每隔１０ ｍｉｎ振蕩混勻１次，冷卻至室溫，加入２５０ μＬ苯酚與２５０ μＬ氯仿－異戊醇（體積比為２４∶１），顛倒混勻。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液于另一新ＥＰ管中，加入等體積的氯仿－異戊醇（體積比為２４∶１），顛倒混勻數次，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；取上清液于另一ＥＰ管中，加入０．８倍體積的異戊醇，１／１０體積３ ｍｏｌ／Ｌ醋酸鈉溶液，顛倒混勻，于－２０℃靜置１ ｈ。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄去上清液，用７０％乙醇洗滌，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清，倒置于吸水紙上室溫晾干。加２０ μＬ ＴＥ溶液溶解，－２０℃保存備用。實驗重復３次。

１．２．４試劑盒法采用的試劑盒為Ｐｒｏｍｅｇａ公司生產的ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，實驗嚴格按使用說明書進行。與上述方案一樣，菌絲重量和最后加入ＴＥ溶液體積都相同。實驗重復３次。

１．３ＤＮＡ含量的測定

將提取的油菜莖基潰瘍病菌基因組ＤＮＡ樣品做適當稀釋，在紫外分光光度計中分別測定Ａ２６０和Ａ２８０值，計算ＤＮＡ純度（Ａ２６０／Ａ２８０比值），并將Ａ２６０值轉換成ＤＮＡ的提取效率（μｇ／ｍｇ）。

１．４ＰＣＲ擴增

應用Ｔａｙｌｏｒ［４］設計的引物ＬＭ４２５９Ｆ：５′－ＧＣＧＴＡ

ＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＣＴＴＡＧＡＧＴＣ－３′和４８３９ＣＲ：５′－ＴＣＣ

ＴＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＡＧＣ－３′對上述4種方法提取的ＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增，預期產物為５８０ｂｐ的片段。ＰＣＲ反應體系（２５ μＬ）為：１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．５ μＬ，Ｔａｑ 酶２．５ Ｕ，ＤＮＡ模板１．０ μＬ，正反引物各１．０ μＬ，雙蒸水１８．５ μＬ。ＰＣＲ反應條件為： ９４℃預變性５ ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｓ、５８℃ ３０ ｓ、７２℃ ４０ ｓ，３５ 個循環；７２℃延伸７ ｍｉｎ。以相同體積的水作為空白對照。取５ μＬ ＰＣＲ擴增產物進行１．２％瓊脂糖凝膠電泳分析。

２結果與分析

２．１４種方法提取DNA的過程比較

４種基因組ＤＮＡ提取方法的主要差別在于提取液即細胞裂解的試劑組成不同，菌絲與提取液混勻后處理的溫度和時間也不同。其中尿素法提取最簡便、快速，全過程約１．５ ｈ，５５℃水浴３０ ｍｉｎ即可，而其余３種方法均需要６５℃ 以上的溫度處理１ｈ。試劑盒法需要３７℃和６５℃ ２種不同的溫度處理，但無有機試劑酚、氯仿抽提步驟，操作更安全、方便。

２．２４種方法提取的ＤＮＡ純度和效率比較

４種不同方法提取基因組ＤＮＡ的純度和效率見表１。ＤＮＡ樣品的Ａ２６０／Ａ２８０比值均在１．６～１．８之間，表明所得ＤＮＡ樣品純度較好，４種方法之間相差不大。試劑盒法提取效率最高，尿素法與之接近，而ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和ＣＴＡＢ法效率明顯偏低。與試劑盒法相比，尿素法提取效率略低，達到０．４２ μｇ／ｍｇ（菌絲），ＣＴＡＢ法效率最低，僅為０．１５ μｇ／ｍｇ（菌絲）。

２．３ＰＣＲ擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

取５ μＬ ＰＣＲ擴增產物進行１．２％瓊脂糖凝膠電泳，用ＴａＫａＲａ公司的ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００作參照。擴增產物的電泳結果顯示，這４種方法都可以擴增到清晰的５８０ ｂｐ條帶，而且不見明顯的非特異性雜帶（圖１）。這與表１中ＤＮＡ的純度數據吻合，它們的純度（Ａ２６０／Ａ２８０）都達到１．６以上、2.0以下，符合ＰＣＲ擴增的要求。

３討論

植物病原真菌基因組ＤＮＡ的提取通常借鑒植物基因組ＤＮＡ提取方法，如ＣＴＡＢ和ＳＤＳ－ＣＴＡＢ方法［２，３］。但目前尿素提取法在病原真菌上應用還較少見。尿素提取法操作簡單，不需要劇烈的振蕩及高溫處理，不容易造成ＤＮＡ斷裂降解。試劑盒法是口岸檢驗檢疫系統通用的方法，提取過程相對簡單，可將人為的失誤降低到最低，但成本較高。本研究結果顯示，在考慮提取成本的情況下，尿素法提取油菜莖基潰瘍病菌基因組ＤＮＡ可以作為一種選擇途徑。

盡管不同方法所得的ＤＮＡ提取效率相差很大，但它們的純度都比較好，可以滿足ＰＣＲ擴增的要求，因此４種方法都可以擴增到清晰的特異性片段。根據本研究中不同方案的ＤＮＡ提取效率、快速簡便低成本等特點，以及前人的研究結果［２，３］，尿素提取法具有明顯的應用價值。在本研究中，ＰＣＲ擴增的模板是菌絲ＤＮＡ，該提取方案在油菜莖基潰瘍病菌ＰＣＲ檢測的靈敏性，以及在實際樣品檢測中的效果等值得進一步評估。

致謝：中國檢驗檢疫科學研究院吳品珊研究員和上海出入境檢驗檢疫局易建平研究員在實驗方面給予了無私的指導和幫助，特此感謝。

參考文獻：

［１］ ＷＩＬＬＩＡＭＳ Ｒ Ｈ， ＦＩＴＴ Ｂ Ｄ Ｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ａ ａｎｄ Ｂ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ， ｃａｕｓａｌ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃａｎｋｅｒ （ｂｌａｃｋｌｅｇ） ｏｆ ｏｉｌｓｅｅｄ ｒａｐｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， １９９９， ４８：１６１－１７５．

［２］ 劉少華，陸金萍，朱瑞良，等．一種快速簡便的植物病原真菌基因組ＤＮＡ提取方法［Ｊ］． 植物病理學報，２００５，３５（４）：３６２－３６５．

［３］ 漆艷香，謝藝賢，張欣，等．ＳＤＳ－ＣＴＡＢ和高鹽沉淀法提取香蕉枯萎病菌基因組ＤＮＡ的比較［Ｊ］．中國生物工程雜志，２００５，２５（３）：４９－５２．

［４］ ＴＡＹＬＯＲ Ｌ Ｊ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓｅｅｄ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｌｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３， ５９（１１）： ３６８１－３６８５．