大孔樹脂純化金毛狗脊葉黃酮的工藝研究

摘要：比較４種大孔樹脂純化金毛狗脊葉總黃酮的性能及工藝，結果表明，ＤＡ－２０１樹脂對金毛狗脊葉總黃酮有良好的吸附及解吸性能。其靜態分離純化工藝的最佳參數為ＤＡ－２０１大孔樹脂與提取液的比例為１∶５（Ｗ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、提取液ｐＨ值為３、恒溫振蕩時間２ ｈ、解吸液為６０％的乙醇。動態分離純化工藝的最佳參數為吸附和解吸最佳流速均為１ ｍＬ／ｍｉｎ、解吸液體積為４倍柱體積。

關鍵詞：大孔樹脂；金毛狗脊葉；總黃酮；純化

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0583-0４

Study on the Purification of Flavonoid from the Leaves of Cibotium barometz（L）J. Sm.

by Macroporous Resin

ＬＩＮ Ｙａｎ－ｒｕ１，２，ＣＡＯ Ｑｉａｎ－ｙｏｎｇ１

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００３１，Ｊｉａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈａｎｓｈａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｏｚｈｏｕ ５２１０４１，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｏｕｒ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｏｔａl ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｉｂｏｔｉｕｍ ｂａｒｏｍｅｔｚ（L）J. Sm． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＡ－２０１ ｒｅｓｉｎ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ａｂｓｏｒｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃ． ｂａｒｏｍｅｔｚ （L）J. Sm． Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｉｔｓ ｓｔａｔｉｃ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗｅｒｅ： ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｒｅｓｉｎｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｔ １∶５（Ｗ∶Ｖ，g∶mL）， ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｔ ３， ｓｈａｋｅ ａｔ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ２ｈ， ａｎｄ ６０％ ａｌｃｏｈｏｌ ａｓ ｅｌｕａｎｔ． Ｉｎ ｄｙｎａｍｉｃ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ： ｂｏｔｈ ｔｈｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｌｕａｎｔ ｆｌｏｗ ｓｐｅｅｄ ｗｅｒｅ ａｔ １ ｍＬ／ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌｕａｎｔ ｗａｓ ４ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｎ ｂｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎ； Ｃｉｂｏｔｉｕｍ ｂａｒｏｍｅｔｚ（L）J. Sm.； ｆｌａｖｏｎｏｉｄ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

金毛狗脊（Ｃｉｂｏｔｉｕｍ ｂａｒｏｍｅｔｚ（Ｌ）Ｊ．Ｓｍ．）又名金毛狗，為蚌殼蕨科（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａｃｅａｅ）金毛狗屬植物，廣泛分布在我國南方和西南地區，其根莖為常用中藥狗脊［１］。

據前人研究，金毛狗脊嫩葉具有清熱涼血、利尿通淋等功效，可治療腸炎、痢疾等癥［２］。金毛狗脊葉也含有豐富的活性物質，主要為黃酮類物質［３，4］。黃酮類化合物廣泛分布于植物藥中，其主要作用有抗菌、抗突變、降壓、消熱解毒、鎮靜、利尿、抗氧化、抗癌，以及降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老等［5］。但金毛狗脊葉卻常常被丟棄，造成資源浪費，為了更好地開發金毛狗脊葉的藥用價值，筆者對金毛狗脊葉總黃酮的分離純化工藝進行了初步研究。

大孔吸附樹脂是近十幾年來發展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，它的物理化學穩定性高，吸附選擇性獨特，不受無機物存在的影響，再生簡便，解吸條件溫和，使用周期長，易于構成閉路循環，節省費用等被廣泛用于生化物質的分離純化［6，7］。

本試驗選擇了４種大孔吸附樹脂對金毛狗脊葉中總黃酮粗提物進行靜態吸附解吸，從中篩選出選擇性好、吸附率高、易解吸的適合金毛狗脊葉總黃酮粗提物分離純化的大孔樹脂，并對其純化的方法和條件做了進一步的研究，為今后工業化研究和開發金毛狗脊葉黃酮類產品奠定了基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１金毛狗脊葉與試劑金毛狗脊葉采于潮州市西湖山上，洗凈，自然晾干，６０℃烘干，粉碎，備用。蘆丁對照品（國藥集團化學試劑有限公司）；ＦＬ－１、ＦＬ－３、ＡＢ－８、ＤＡ－２０１大孔吸附樹脂（天津歐瑞生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

１．１．２主要儀器設備７５２Ｓ紫外可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）；格蘭仕電腦型燒烤微波爐（順德市格蘭仕電器實業有限公司）；ＢＴ－１００Ｂ數顯恒流泵（上海瀘西分析儀器廠）；ＥＴ－Ｑ型氣浴恒溫振蕩器（常州榮冠實驗分析儀器廠）；ＰＨＳ－３Ｃ精密酸度計。

１．２方法

１．２．１標準曲線的繪制參照文獻［8］中的方法，以吸光值（Ａ）為縱坐標，蘆丁質量濃度（Ｃ）為橫坐標，繪制標準曲線，得到蘆丁質量濃度（Ｃ）與吸光值（Ａ）關系曲線的回歸方程為Ａ＝８．４５４ １Ｃ＋０．００９ ５，

ｒ＝０．９９８ ８。

１．２．２樹脂的預處理［9］新購吸附劑含有未聚合單體、致孔劑、分散劑等殘留的雜質成分，使用前必須加以處理。具體操作如下：用足量的９５％乙醇浸泡２４ ｈ，抽濾，再用大量去離子水洗滌至無乙醇味即可。處理完畢后裝入廣口瓶中，用去離子水浸泡，備用。

１．２．３金毛狗脊葉總黃酮粗提液的制備及含量測定稱取５．０ ｇ金毛狗脊葉樣品，加入２０.0 ｍＬ去離子水，微波１ ｍｉｎ后，冷卻至室溫，加入１１０.0 ｍＬ去離子水及９０.0 ｍＬ ９５％乙醇，混合均勻后，于９０℃恒溫槽中回流１ ｈ。得到萃取液，減壓抽濾，收集濾液，備用。按照標準曲線的方法測定總黃酮含量。

１．２．４樹脂對金毛狗脊葉黃酮吸附率的測定［１0］準確稱取預處理好的樹脂１．０ ｇ，置于５０.0 ｍＬ具塞磨口三角瓶中，加入一定濃度的金毛狗脊葉黃酮粗提液１０.0 ｍＬ，置于氣浴恒溫振蕩器中（２５℃，１２０

ｒ／ｍｉｎ），充分振蕩１２ ｈ，至吸附平衡，取上層清液，測定其黃酮含量，并按照下式算出吸附率。

吸附率＝×100%

１．２．５樹脂對金毛狗脊葉黃酮解吸率的測定［１0］將１．２．４中充分吸附后的樹脂用去離子水清洗至樹脂表面無黃酮溶液殘留，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，然后置于５０.0 ｍＬ具塞三角瓶中，加入１０.0 ｍＬ ６０％乙醇，置于氣浴恒溫振蕩器中（２５℃，１２０ ｒ／ｍｉｎ）振蕩解吸１２ ｈ， 至解吸平衡，取上層清液測定總黃酮含量，并按照下式算出解吸率和得率。

解吸率＝（解吸液濃度×解吸液體積）／［（提取液濃度－吸附平衡后溶液濃度）×提取液體積］×１００％；得率＝（解吸液濃度×解吸液體積）／（提取液濃度×提取液體積）。

２結果與分析

２．１不同樹脂對金毛狗脊葉黃酮的靜態吸附率和解吸率［１0］

ＦＬ－１、ＦＬ－３、ＡＢ－８、ＤＡ－２０１大孔樹脂對金毛狗脊葉黃酮粗提液中金毛狗脊葉總黃酮的靜態吸附率見圖１，靜態解吸率見圖2，黃酮得率結果見圖3。

從圖１～３可以看出，ＦＬ－１對金毛狗脊葉提取液中的黃酮類物質具有極高的吸附能力，但解吸率很低，說明金毛狗脊葉中黃酮的極性較大，ＦＬ－１樹脂與其的結合能力較強，不利于后續黃酮類物質的解吸。ＤＡ－２０１對金毛狗脊葉總黃酮的吸附率和解吸率都較高，得率可達４０．１％，而ＦＬ－３和ＡＢ－８樹脂雖有一定的吸附和解吸能力，但效果均不如ＤＡ－２０１樹脂。因此，選用ＤＡ－２０１樹脂純化金毛狗脊葉總黃酮。

２．2ＤＡ－２０１大孔樹脂純化條件的確定

２．2．１ＤＡ－２０１大孔樹脂靜態吸附與解吸試驗按照１．２．４、１．２．５的試驗方法，考察各種不同條件下，ＤＡ－２０１樹脂對提取液的吸附和解吸能力。①不同吸附方式下作用時間對靜態吸附的影響［１1］。準確吸取兩份提取液２０．０ ｍＬ，各加入４．０ ｇ樹脂，分別進行振蕩吸附與靜置吸附。每小時吸取０．５ ｍＬ，測定其黃酮濃度，得出吸附率，繪制靜態吸附動力學特征曲線（圖４）。圖4表明，振蕩吸附的效果明顯優于靜置吸附，并且當振蕩吸附時間達到２ ｈ時，吸附量趨于飽和，故確定靜態吸附時間為２ ｈ。②樹脂用量對靜態吸附的影響［１2］。將樹脂與提取液按照不同的比例即料液比混合（１∶５、１∶１０、１∶２０、１∶３０），并置于氣浴恒溫振蕩器中（搖床１２０ ｒ／ｍｉｎ），充分振蕩３ ｈ，測定樹脂的吸附效果。結果表明（圖5），料液比為１∶５時，樹脂對黃酮的吸附率最高，可達８１．２％。③提取液ｐＨ值對靜態吸附的影響［１3］。將提取液調成不同ｐＨ值進行靜態吸附。結果表明（圖6），提取液的ｐＨ值對樹脂的吸附作用有很大的影響，在中性條件下樹脂的吸附率較低，在酸性（ｐＨ值為３）和堿性（ｐＨ值為１２）條件下吸附率較高，分別可達到８３．２％和８１．８％。④解吸液體積濃度對靜態解吸的影響。配制一系列不同體積百分數的乙醇溶液，準確吸取一定量體積，加入到已吸附飽和的樹脂，振蕩１２ ｈ后，測定解吸率。結果表明（圖7），６０％的乙醇溶液對樹脂的解吸效果最好，乙醇濃度過大或過小都不能達到最佳的解吸效果。這是因為，黃酮類物質易溶于乙醇，而在水中的溶解度較低，乙醇濃度的降低不利于解吸；當乙醇濃度偏高時，解吸液的極性降低，同樣也不利于解吸。只有當乙醇濃度適中時才可達到較好的解吸效果［１4］。

２．2．２ＤＡ－２０１大孔樹脂動態吸附與解吸試驗①流速對動態吸附的影響［１4］。將預處理好的樹脂裝入層析柱中，柱體積為１５.0 ｍＬ，通過恒流泵控制提取液流速分別為１、２、３ ｍＬ／ｍｉｎ，每５．０ ｍＬ收集一次流分，并測定其濃度，得出吸附率。結果表明（圖8、圖9），流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ時的泄漏點較晚出現，且吸附率較高，其原因可能是流速較慢時提取液與樹脂接觸的時間較長，有利于黃酮類物質從液相擴散到樹脂內部，從而提高了吸附率。因此，動態吸附的最佳流速為１ ｍＬ／ｍｉｎ。②流速對動態解吸的影響［9］。將已吸附飽和的樹脂裝入層析柱中，柱體積為１５.0 ｍＬ，用６０％的乙醇溶液進行動態解吸，通過恒流泵控制乙醇流速分別為１、２、３ ｍＬ／ｍｉｎ，每５．０ ｍＬ收集一次流分，并測定其濃度。結果表明（圖10），以

１ ｍＬ／ｍｉｎ的流速進行解吸得到的峰形最窄，峰值最高，幾乎無拖尾現象，解吸效果較好，而以２ ｍＬ／ｍｉｎ和３ ｍＬ／ｍｉｎ的流速解吸得到的峰值較低。這可能是由于流速過快時，乙醇溶液與樹脂的接觸時間較短，乙醇分子來不及與樹脂充分作用就已流出，導致解吸曲線的峰值較低，解吸效果較差。因此，選用１ ｍＬ／ｍｉｎ為解吸流速。由曲線圖也可看出，當解吸液體積為４倍柱體積（６０．０ ｍＬ）時，樹脂中黃酮類物質已基本被解吸下來。

３結論

考察了４種不同型號大孔樹脂對金毛狗脊葉黃酮的吸附和解吸能力。結果表明，ＤＡ－２０１大孔樹脂對金毛狗脊葉黃酮具有良好的純化作用。其靜態分離純化工藝的最佳條件為ＤＡ－２０１大孔樹脂與提取液的比例為１∶５、提取液ｐＨ值為３、恒溫振蕩時間２ ｈ、解吸液為６０％的乙醇。動態分離純化工藝的最佳條件為吸附和解吸最佳流速均為１ ｍＬ／ｍｉｎ、解吸液體積為４倍柱體積。

金毛狗脊葉植物資源分布廣，黃酮類物質含量較高，利用大孔樹脂考察分離純化金毛狗脊葉黃酮的最佳工藝，為其在醫藥和食品加工中的應用提供了理論基礎。

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