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蘇云金芽孢桿菌幾丁質酶基因的克隆及誘導表達

2011-04-29 00:00:00蔡亞君袁志明胡曉敏蔡全信
湖北農業科學 2011年3期

摘要:從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因組DNA,通過PCR的方法克隆了幾丁質酶chiAC基因(GenBank登錄號為EF427670)。置換chiAC基因的啟動子為T7啟動子時,chiAC基因能在IPTG誘導下在大腸桿菌中大量表達,并產生大小約70 kDa的表達產物。

關鍵詞:蘇云金芽孢桿菌;幾丁質酶基因;克隆;序列分析;表達

中圖分類號:Q786文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2011)03-0599-04

Cloning and Expression of Chitinase Encoding Gene of Bacillus thuringiensis

T04A001 Strain

CAI Ya-jun1,2,YUAN Zhi-ming2,HU Xiao-min2,CAI Quan-xin2

(1. Institute of Environmental Science,Wuhan Textile University,Wuhan 430073,China;

2. Wuhan Institute of Virology,The Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

Abstract: Chitinase gene chiAC(GenBank Accession Number:EF427670) was cloned by PCR from Bacillus thuringiensis T04A001 genomic DNA. Expression of chiAC under T7 promoter in Escherichia coli could induced by IPTG; and it produced a protein whose molecular weight was about 70 kDa.

Key words: Bacillus thuringiensis; chitinase gene; clone; sequence analysis; expression

幾丁質酶在芽孢桿菌中廣泛存在,目前已有多種芽孢桿菌的幾丁質酶基因得到了克隆與表達,如環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、蠟狀芽孢桿菌(B. cereus)、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis,簡稱Bt)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)以及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)等[1,2]。蘇云金芽孢桿菌因為對多種害蟲具有毒殺作用而一直為人們所關注,目前已有十多個亞種的蘇云金芽孢桿菌被證明能產生幾丁質酶[3]。有報道證明,蘇云金芽孢桿菌自身產生的幾丁質酶對其殺蟲毒力具有增效作用,其殺蟲毒力與幾丁質酶的活力呈高的正相關(0.75~0.79)[4],表明幾丁質酶在外界因素對害蟲的侵害中起著重要的作用。增加外源的幾丁質酶可以提高蘇云金芽孢桿菌殺蟲效果,而用阿洛菌素(一種幾丁質酶抑制劑)抑制蘇云金芽孢桿菌的幾丁質酶后,LC50值增高[5]。因此,對蘇云金芽孢桿菌幾丁質酶的性質、編碼基因的序列差異性以及幾丁質酶基因的表達等方面進行研究,可為幾丁質酶更好的應用于生物防治提供依據。

本研究對產幾丁質酶活力高的Bt菌株T04A001[6]的幾丁質酶基因進行了克隆、測序分析,并將T04A001菌株的幾丁質酶基因chiAC的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)在T7啟動子調控下進行原核表達。幾丁質酶基因的序列測定及其在大腸桿菌中的大量表達為研究芽孢桿菌幾丁質酶的進化關系、幾丁質酶的純化與制備及更進一步研究提供了條件。

1材料與方法

1.1菌株與培養基

Bt菌株T04A001為本實驗室分離保藏,大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21為本實驗室保存菌株。LB培養基(每升含10 g蛋白胨,5 g酵母粉,10 g NaCl);氨芐青霉素和卡那霉素使用終濃度分別為50 μg/mL和30 μg/mL,IPTG 使用終濃度為

1 mmol/L。

1.2主要試劑與儀器

所用內切酶均購自TaKaRa公司;質粒提取、PCR產物回收和DNA片段快速純化試劑盒購自New England Biolabs公司;His-bind親和層析蛋白純化試劑盒購自Novagen公司;其余常規試劑均為Sigma進口分裝。主要儀器有美國Biotecsynergy HT全波長自動酶標儀,美國ABI 9800 PCR儀,電泳系統為美國BioRad DNA電泳系統和蛋白質電泳系統。

1.3DNA的提取

大腸桿菌質粒DNA提取參照《分子克隆實驗指南》第二版(1989)小量堿法進行[7]。

芽孢桿菌的總DNA按照如下方法提取。將芽孢桿菌單菌落接入LB培養基中,30℃ 200 r/min振蕩培養4~5 h至OD600約0.6~0.8,取1.5 mL菌液至Eppendorf管中,離心收集菌體,用TES緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、pH值為8.0,5 mmol/L EDTA、pH值為8.0,20%蔗糖)洗滌菌體1次,沉淀中加入500 μL含10 mg/mL溶菌酶的TES,混勻后37℃下作用1.0~1.5 h至菌體形成原生質球,加100 μL 10% SDS溶液及終濃度為2 mg/mL的蛋白酶K,上下顛倒數次混勻,37℃下作用1 h,12 000 r/min離心10 min,上清加等體積的酚氯仿抽提后,加入兩倍體積預冷無水乙醇溫和混勻,-20℃放置30 min左右后12 000 r/min離心10 min,沉淀用70%乙醇洗滌,風干,最后溶于含2 mg/mL RNA酶的適量的無菌去離子水中。

1.4幾丁質酶基因的PCR擴增

根據GenBank中Bt以色列亞種幾丁質酶基因(GenBank序列號為AF526379)全序列設計了擴增引物[8],ICHI1 5′-GTCGACTTTCCTCCCATACCA-3′(帶SalⅠ酶切位點),CCHI1 5′-GGGGCATGCATGCCTTAAATATATC-3′(帶EcoRⅠ酶切位點),CCHI2 5′-GGGGCATGCATGCCTTAAATATATC-3′(帶HindⅢ酶切位點)。擴增體系為:芽孢桿菌總DNA 0.1 μg,1×PCR Buffer 2.5 μL, 2.5 pmol dNTPs,

Taq plus(Taq+pfu DNA polymerase)1 U,引物各

10 pmol,加ddH2O至25 μL。擴增程序為:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,50℃退火3 min,72℃延伸3 min,28個循環;72℃延伸7 min。

1.5幾丁質酶基因的克隆

以Bt菌株T04A001總DNA為模板,ICHI1/CCHI2為引物,PCR擴增得到包含啟動子和chiAC基因ORF和終止子的幾丁質酶全長基因,將PCR產物(為確保PCR產物末端加上了A殘基,擴增完成后直接向PCR反應管中加入1U Taq DNA polymerase,72 ℃延伸30 min),用PCR產物回收試劑盒純化回收后連接到PCR產物克隆載體pMD18-T上,連接產物轉化進E. coli DH5α,在氨芐青霉素抗性LB平板上挑取白色克隆子,提取質粒酶切鑒定,得到T04A001幾丁質酶基因的正確克隆子E-pMDC26,送往上海博道生物公司測序。

1.6用于幾丁質酶基因原核表達的重組質粒的構建

以CCHI1/CCHI2為引物PCR擴增得到不含啟動子序列的chiAC基因ORF,其兩端分別帶有EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點,PCR產物經PCR產物回收試劑盒純化回收后EcoR I/Hind Ⅲ雙酶切。雙酶切后的PCR片段與表達質粒pET28a EcoRⅠ/Hind Ⅲ酶切后的片段連接,將連接產物轉化E.coli DH5α后在卡那霉素抗性LB平板上篩選克隆子,隨機挑取菌落提取質粒進行酶切鑒定,鑒定正確的質粒即為chiAC基因在質粒pET28a T7啟動子控制下表達的重組質粒,命名為pETC21。

1.7幾丁質酶的誘導表達及蛋白質純化

將質粒pETC21轉化E. coli BL21,得到用于誘導表達的重組菌株E-pETC21。E-pETC21接到

5 mL LB液體培養基中,30℃震蕩培養(200 r/min)過夜,按1∶1 000比例轉接到500 mL的新鮮LB中,當菌液培養至OD600約0.6時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導繼續培養4 h,取樣處理后經His-bind親和層析試劑盒純化得到表達的幾丁質酶。具體純化方法見試劑盒說明。考馬斯亮藍G250染色法測定純化的蛋白質濃度。3,5-二硝基水楊酸測定幾丁質酶活力[6]。一個酶活力單位(U)定義為合適溫度下每小時產生1 μg還原糖的酶量。

1.8抗血清制備和Western blot分析

約400 ng的純化的ChiAC蛋白質經SDS-PAGE分離、考馬斯亮藍染液染色、脫色后,將70 kDa目的蛋白帶切下,凍融3次,用研缽研碎,懸浮于1 mL生理鹽水中。蛋白樣品制備好后,注射兔子進行免疫反應。2周后加強一次注射免疫,1個月后再一次加強,1個半月后取兔血,離心得到70 kDa ChiAC的抗血清。制備E-pET28a菌體破碎后的可溶性部分0.5 mL,與10 mL抗血清在4℃孵育過夜,然后3 000 r/min離心3 min,除去所有抗原抗體凝集反應的沉淀,得到去除宿主菌雜抗體的抗血清。本研究經摸索后確定Western blot分析均用1 000倍稀釋度的ChiAC抗血清進行一抗雜交。Western blot方法按《分子克隆實驗指南》[7]進行。

2結果

2.1幾丁質酶基因和氨基酸序列分析

序列測定表明,Bt菌株T04A001的幾丁質酶基因編碼序列(GenBank登錄號為EF427670)由2 031個核苷酸組成,是編碼676個氨基酸的74 kDa蛋白質。與GenBank中其他ChiA家族幾丁質酶基因進行核酸序列比對,菌株T04A001(H4血清型)幾丁質酶基因chiAC的全序列與B. thuringiensis subsp. israelensis(H14血清型)幾丁質酶基因ichi相似性最高,為99%;與B. thuringiensis subsp. konkukian(H34血清型)幾丁質酶基因Bt及B. thuringiensis subsp. kenyae(H4a4c血清型)幾丁質酶基因chiA74相似98%;與B. thuringiensis subsp. sotto(H4a4b血清型)幾丁質酶基因Bts相似96%;與B. thuringiensis subsp. pakistani(H13血清型)幾丁質酶基因chiA71相似80%;與枯草芽孢桿菌幾丁質酶基因Bsu相似42%;與地衣芽孢桿菌TP菌株幾丁質酶基因Bl相似28%;與S. marcescens菌株141 幾丁質酶基因Sm相似7%(見圖1)。

將chiAC翻譯得到的蛋白序列ChiAC與GenBank中其他Bt菌株的幾丁質酶進行比對,結果顯示ChiAC與其他Bt菌株的幾丁質酶存在高度相似性,與B. thuringiensis subsp. pakistani幾丁質酶ChiA71相似性為70%,與B. thuringiensis subsp. konkukian幾丁質酶Bt相似性為93%,與B. thuringiensis subsp. israelensis及同為H4血清型的B. thuringiensis subsp. sotto幾丁質酶相似性為97%,與B. thuringiensis subsp. kenyae幾丁質酶ChiA74相似性則有99%。這些Bt菌株的幾丁質酶均屬于糖基水解酶18家族,且同為ChiA。

在ChiAC的N端,首先是一段34氨基酸的信號肽,該信號肽能被革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及其他原核生物識別,在革蘭氏陰性菌中其斷裂位點是Leu-33和Ala-34,在革蘭氏陽性菌和其他原核生物中其斷裂位點是Ala-34和Asp-35。其后為催化區,該結構域在Bt菌株的幾丁質酶中高度保守,與幾丁質酶活性相關的Asp-207、Asp-209和Glu-211高度保守。催化區之后為兩個纖粘蛋白相似區(Fbronectin-like domain,FLD),盡管兩個FLD相互之間相似性很低(10%左右),但均含有粘蛋白的典型保守氨基酸殘基(FLD1:Trp-373、Tyr-384和Tyr-411;FLD2:Trp-507、Tyr-519和Tyr-546)。在Bt菌株的幾丁質酶中,僅巴基斯坦亞種幾丁質酶不含FLD1,其余幾丁質酶FLDs的相似性均達到90%以上。在FLDs之后為位于C端的幾丁質結合區,其保守殘基為Trp-591、Tyr-595和Trp-626,Bt菌株的幾丁質酶的該結構域相似性也均達到90%以上。

2.2chiAC基因在T7啟動子下的表達

幾丁質酶基因chiAC ORF插入載體pET28a,得到chiAC基因ORF在T7啟動子調控下的重組表達質粒pETC21,轉進E. coli BL21中,得到重組菌株E-pETC21。對E. coli BL21、E-pET28a、E-pETC21全菌體和純化的幾丁質酶進行SDS-PAGE和Western blot分析,原始菌株E. coli BL21和轉化空載體的對照菌株E-pET28a均不產生幾丁質酶,而E-pETC21及由其所提取的幾丁質酶均能觀察到ChiAC蛋白質對應的70 kDa表達帶,同時還可觀察到兩條大小分別約40 kDa和29 kDa的降解蛋白質條帶(圖2)。

2.3在E-pETC21中的表達時相分析

同時接種兩瓶E-pETC21培養,當培養4 h時OD600均達到約0.6,此時在一個搖瓶中加入1 mmol/L IPTG繼續培養,另一瓶則不加IPTG用作對照。由圖3可知,在加入IPTG誘導后菌株的生長明顯受到抑制,菌體OD600最高僅能達到0.8左右,而未加IPTG誘導的菌體OD600可達到1.1左右。誘導后菌株的幾丁質酶產量顯著增強,且隨培養時間的延長不斷增長,直至培養100 h左右酶活最高可達到約420 U/mL,之后酶活逐漸下降;而未誘導的E-pETC21雖然也能表達產生幾丁質酶,但其產量不高,酶活最高僅能達到100 U/mL。

3討論

本研究所克隆的Bt菌株T04A001的幾丁質酶基因chiAC包括啟動子、編碼區和終止子序列,其編碼區由分泌信號肽、催化區、FLDs和幾丁質結合區4個結構域組成。蛋白質前體的信號肽符合原核生物信號序列特點,即N末端帶電荷,其后形成一個疏水中心以及極性氨基酸串。成熟的ChiAC蛋白質的N端存在一個催化區,與糖基水解酶18家族的催化區有較高的同源性,其中D207、D209、E211高度保守,可能是質子供體。催化區后有兩個與Fn Ⅲ結構域有同源性的區域——FLDs。該結構域對幾丁質酶與幾丁質的結合作用無影響,卻與膠狀幾丁質降解程度有關。目前已在Bacillus sp.、Streptomyces sp.等細菌的幾丁質酶中發現了FnⅢ同源結構域。除幾丁質酶外,α-淀粉酶、纖維素酶、PHB解聚酶等也存在FnⅢ同源結構域。在進行氨基酸序列比對時發現,在其他結構域高度相似的情況下,同時具有FLD1和FLD2的Bt菌株的幾丁質酶ChiA74為內切酶,而缺少FLD1區域的ChiA71卻為外切酶,因此推測FLD1可能影響了幾丁質酶的水解切口部位,同時推測與ChiA74相似度達99%且具有FLD1的ChiAC也為內切酶。ChiAC蛋白C端幾丁質結合區中的芳香族氨基酸——酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)也是高度保守的,該結構域能特異結合不可溶幾丁質(如膠狀幾丁質或再生幾丁質)及晶體幾丁質,卻不能與可溶性幾丁質及其他不溶性多糖結合。

幾丁質酶基因chiAC在載體pET28a的T7啟動子調控下能夠誘導表達,雖然其自身具有較高的本底表達水平,但在IPTG誘導下,幾丁質酶產量能夠得到顯著且迅速的提高。表達的幾丁質酶在胞內和胞外都能檢測到。對菌體進行時相SDS-PAGE分析顯示,在37℃誘導培養時,加入1 mmol/L IPTG后的最初2 h內可觀察到逐漸增強的70 kDa表達蛋白質條帶,但之后繼續培養,則表達帶的強度保持不變(數據未顯示)。對比酶活時相檢測誘導后酶活不斷增強的結果,表明在大腸桿菌中誘導表達的幾丁質酶主要分泌到了胞外。此外,在SDS-PAGE和Western blot分析中,重組菌株在表達產生70 kDa幾丁質酶ChiAC的同時還產生兩條大小分別為40 kDa左右和29 kDa左右的蛋白質條帶,推測它們是70 kDa ChiAC的降解產物。

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