煙色曲霉發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶條件的研究

摘要：以殼聚糖為惟一碳源從采集的土樣中分離得到一株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為煙色曲霉。對測定殼聚糖酶活力的ＤＮＳ法以及該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行了初步研究。結果表明，ＤＮＳ法的最大吸收波長在４９０ ｎｍ左右，試驗菌株的最適產(chǎn)酶發(fā)酵條件為分別以1.00%殼聚糖和1.00%牛肉膏為碳源和氮源，２５０ ｍＬ三角瓶裝液量為７５ ｍＬ，起始ｐＨ值是５．８，接種量１．５％（Ｖ／Ｖ），３８℃，２１０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)７７ ｈ。在最適產(chǎn)酶條件下，該菌株發(fā)酵液中殼聚糖酶活力可達到７．２５ Ｕ／ｍＬ。

關鍵詞：煙色曲霉；殼聚糖酶；發(fā)酵條件；酶活

中圖分類號：Ｑ９３９．５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）03－0576-04

Study on the Conditions of Fermenting Chitosanase from Aspergillus fumigatus

ＴＵ Ｓｈａｏ－ｙｏｎｇa，ＤＥＮＧ Ｙａ－ｌｉa，ＹＡＮＧ Ａｉ－ｈｕａb，ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｎ－ｌｉa，ＷＡＮＧ Ｙａｎｇa

（ａ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｂ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，

Ｗｕｈａｎ ４３０４１５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｅ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ， ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＤＮＳ ｍｅｔｈｏｄ ｔｈａｔ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＤＮＳ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ 4９０ｎｍ； ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｕｓｉｎｇ 1.00% ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｓ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ1.00% ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ａｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ， ２５０ｍL ｆｌａｓｋ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ７５ ｍL ｍｅｄｉｕｍ， ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ ５．８，ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ３８℃， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ａｍｏｕｎｔ １．５％（V/V） ａｎｄ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ２１０ ｒ/min ｆｏｒ ７７ ｈｏｕｒｓ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｉｖｉｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， tｈｅ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ７．２５Ｕ／ｍL．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ； ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ； ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ

殼聚糖（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）是甲殼素脫乙酰化產(chǎn)物，是自然界中惟一的一種天然陽離子高聚物［１］。殼聚糖被譽為人體第六生命要素，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領域有廣泛的用途［２］。殼聚糖來源豐富，但由于分子量大，不溶于水和普通的溶劑，只能溶于酸性環(huán)境，致使它在各行業(yè)的應用受到了很大的限制［３］。

殼寡糖（Ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）是殼聚糖降解的產(chǎn)物，不僅具有水溶性好、易吸收等優(yōu)點，還具有抗腫瘤、抗菌、免疫激活等獨特的生理功能［４，５］，其應用前景廣闊。

殼聚糖酶（Ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ＥＣ．３．２．１．９９）是催化殼聚糖降解為殼寡糖的專一性酶。殼聚糖經(jīng)殼聚糖酶降解后生成低分子量的殼寡糖，殼聚糖酶在降解殼聚糖、生產(chǎn)殼寡糖中發(fā)揮重要的作用［６］。殼聚糖酶是以殼聚糖為專一性底物的專一性水解酶，專一水解殼聚糖，該酶反應條件溫和，為大規(guī)模生產(chǎn)殼寡糖提供了可能［７，８］。

本試驗從土壤中篩選分離出了一株產(chǎn)殼聚糖酶活力高的菌株，對其進行了初步鑒定，并對酶活測定的ＤＮＳ法和產(chǎn)酶條件進行了研究。

１材料與方法

１．１菌株

酶源菌株由本實驗室自土樣中分離得到。

１．２培養(yǎng)基

平板分離培養(yǎng)基［單位：％（ｍ／Ｖ，ｇ／ｍＬ），下同］，組分配方為膠體殼聚糖１．００、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２０、ＮａＣｌ ０．５０、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１０、瓊脂２．００，ｐＨ值自然。斜面培養(yǎng)基，組分配方同平板分離培養(yǎng)基。復篩（液體發(fā)酵）培養(yǎng)基，組分配方為膠體殼聚糖１．００、葡萄糖０．１０、酵母提取物０．５０、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．００、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０７、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０３、ＮａＣｌ ０．５０、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５，調(diào)ｐＨ值為６．０。正交優(yōu)化培養(yǎng)基，組分配方為膠體殼聚糖１．００、牛肉膏１．００、葡萄糖０．１０、酵母提取物０．５０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０７、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０３、ＮａＣｌ ０．５０、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．０５。培養(yǎng)基滅菌條件為１２１℃，２０ ｍｉｎ；膠體殼聚糖用１１５℃、２０ ｍｉｎ條件單獨滅菌。

１．３試劑

殼聚糖為桓臺縣金湖甲殼制品有限公司的產(chǎn)品，脫乙酰度大于９０％，膠體殼聚糖為實驗室自制，其余試劑均為分析純。

１．４試驗方法

１．４．１初篩將采集的土樣稀釋，取一定量的稀釋液加入到平板分離培養(yǎng)基上，３０℃培養(yǎng)３～５ ｄ，觀察平板培養(yǎng)基上長出的菌落是否出現(xiàn)透明圈。測量透明圈和菌落的直徑大小，計算它們的比例，挑選比值較大者進行分離純化，于斜面培養(yǎng)基上進行保存，以供復篩選用。

１．４．２復篩將初篩菌種分別接入復篩培養(yǎng)基（２５０ ｍＬ三角瓶裝７５ ｍＬ培養(yǎng)基），１５０ ｒ／ｍｉｎ，３０℃下?lián)u瓶培養(yǎng)７２ ｈ，發(fā)酵液經(jīng)６ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液測酶活。

１．５殼聚糖酶活力的測定

采用ＤＮＳ法。取０．１ ｍＬ酶液加入０．９ ｍＬ濃度為１．００％的膠體殼聚糖溶液和１．０ ｍＬ ｐＨ值為５．６的醋酸緩沖溶液，５０℃下保溫１５ ｍｉｎ，加入１．５ ｍＬ ＤＮＳ終止酶促反應，沸水浴顯色５ ｍｉｎ，冷卻后定容至２５．０ ｍＬ，６ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液測最大吸收波長處的ＯＤ值，煮沸滅活的酶液同法處理作為對照，根據(jù)氨基葡萄糖標準曲線求出反應液中的還原糖含量，計算在各種培養(yǎng)條件下殼聚糖酶的酶活力。酶活的定義是在上述條件下，每毫升酶液每分鐘產(chǎn)生１ μｍｏｌ還原糖所需的酶量為１個殼聚糖酶活力單位（Ｕ）。

１．６發(fā)酵產(chǎn)酶條件的研究

１．６．１碳源的選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以１．００％果糖、１．００％木糖、１．００％乳糖、１．００％麥芽糖代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的殼聚糖，裝液量為７５ ｍＬ／２５０ ｍＬ（搖瓶），ｐＨ值為６．０，３０℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)７２ ｈ后分別取樣測量酶活。

１．６．２氮源的選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以1.00% ＮＨ４ＮＯ３、1.00%尿素、1.00%牛肉膏、1.00%蛋白胨代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的（ＮＨ４）２ＳＯ４，裝液量為

７５ ｍＬ／２５０ ｍＬ（搖瓶），ｐＨ值為６．０，３０℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)７２ ｈ后分別取樣測量酶活。

１．６．３裝液量對產(chǎn)酶的影響２５０ ｍＬ的三角燒瓶中分別裝入２５、５０、７５、１００、１２５ ｍＬ的液體發(fā)酵培養(yǎng)液， ｐＨ值為６．０，３０℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)７２ ｈ后分別取樣測量酶活。

１．６．４轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響２５０ ｍＬ的三角燒瓶中裝７５ ｍＬ的液體發(fā)酵培養(yǎng)液， ｐＨ值為６．０，３０℃，分別在１２０、１５０、１８０、２１０、２４０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)７２ ｈ后取樣測量酶活。

１．６．５正交試驗發(fā)酵條件的優(yōu)化在單因素試驗的基礎上，對發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時間和起始ｐＨ值四因素三水平利用Ｌ９（３４）進行正交試驗。

２結果與分析

２．１ＤＮＳ法吸收波長的確定

目前幾乎所有的有關殼聚糖酶酶活測定的ＤＮＳ法中，選定氨基葡萄糖作標準曲線時，波長選擇基本上都是５２０ ｎｍ，但通過掃描標準氨基葡萄糖溶液發(fā)現(xiàn)，不同濃度的氨基葡萄糖的最大吸收峰基本上出現(xiàn)在４９０ ｎｍ左右，如圖１所示，而與５２０ ｎｍ處的吸光值相差甚遠，因此認為選擇４９０ ｎｍ處測量ＯＤ值，靈敏度較高，誤差較小，是最合適的波長選擇，另外通過掃描酶解后的溶液，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰值也出現(xiàn)在４９０ ｎｍ左右，如圖２所示，再次印證了選擇４９０ ｎｍ為吸收波長的準確性。

２．２菌株篩選結果

從采集的土樣中篩選到若干產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，在以膠體殼聚糖為惟一碳源的固體培養(yǎng)基上生長時能夠在菌落周圍產(chǎn)生較大的透明圈，而且透明圈明顯，如圖３所示。依據(jù)《真菌鑒定手冊》［９］，初步確定為煙色曲霉。

２．３搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

２．３．１碳源對產(chǎn)酶的影響添加不同的碳源進行發(fā)酵培養(yǎng)，最后測定酶活（圖４）。從圖４中可以看出以1.00%殼聚糖為碳源時最有利于該菌株產(chǎn)酶。這表明該菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶可能是誘導酶［１０］，受到底物殼聚糖的誘導。

２．３．２氮源對產(chǎn)酶的影響添加不同的氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)，最后測定酶活（圖５）。從圖中可以看出，有機氮源1.00%牛肉膏最適合該菌產(chǎn)酶。這和許多文獻報道的細菌類產(chǎn)殼聚糖酶菌株一般以無機氮源最適合產(chǎn)殼聚糖酶有很大的區(qū)別。

２．３．３裝液量對產(chǎn)酶的影響搖瓶裝液量對產(chǎn)酶的影響結果見圖６。裝液量過低，可能在接種量一定的條件下，提供給單位菌體的營養(yǎng)物質(zhì)不夠；而裝液量過高，可能在一定的搖床轉(zhuǎn)速下提供的溶解氧不夠。在該條件下，使用２５０ ｍＬ的三角燒瓶，裝液量７５ ｍＬ時，酶活力最高。

２．３．４搖瓶轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響搖瓶轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響結果見圖７。從圖中可以看出，隨著轉(zhuǎn)速的提高，殼聚糖酶的活性不斷提高，可見在試驗條件下，該真菌發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶為高好氧條件，但這并不影響該菌在生產(chǎn)實際中的應用。在實驗室中，采用

２０ Ｌ的發(fā)酵罐，很容易就能達到該菌的溶解氧要求，這和搖瓶發(fā)酵本身溶解氧有限的條件有關。

２．３．５搖瓶發(fā)酵的正交試驗由表２結果可知，在不同因素水平下，經(jīng)過搖瓶發(fā)酵，殼聚糖酶酶活發(fā)生了變化，對產(chǎn)殼聚糖酶的影響因素的大小順序依次為，Ａ（發(fā)酵溫度）＞Ｂ（接種量）＞Ｄ（起始ｐＨ值）＞Ｃ（發(fā)酵時間），因此，可以確定發(fā)酵溫度在試驗中起主導作用，接種量次之，起始ｐＨ值再次之，發(fā)酵時間的影響相對較小。最佳參數(shù)組合為，發(fā)酵溫度３８℃，接種量為１．５％，發(fā)酵起始ｐＨ值為５．８，發(fā)酵時間７７ ｈ，在該優(yōu)化條件下，發(fā)酵液的酶活力為７．２５ Ｕ／ｍＬ，比其他試驗組合的結果都高，從而驗證了正交試驗優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶條件的可靠性。

３結論

本研究中，經(jīng)過光譜掃描，確定了測定殼聚糖酶酶活ＤＮＳ法的最適波長。通過菌株篩選，得到了一株高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，經(jīng)初步鑒定為真菌中的煙色曲霉，而有關煙色曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的研究報告還很少見，本研究為煙色曲霉產(chǎn)殼聚糖酶提供了一種參考。

通過對該菌株發(fā)酵條件的研究，確定該菌株產(chǎn)殼聚糖酶最宜的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為，１．0０％殼聚糖為碳源，１．０0％牛肉膏為氮源，起始ｐＨ值５．８，２５０ ｍＬ三角瓶裝７５ ｍＬ培養(yǎng)基，３８℃，接種量１．５％，２１０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)７７ ｈ。在最適產(chǎn)酶條件下，該菌株發(fā)酵液中殼聚糖酶活力可達到７．２５ Ｕ／ｍＬ。

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