激活素A及卵泡抑素基因在糖尿病大鼠腎臟表達的實驗研究*

任小軍 柳 剛 關廣聚

1 山西省人民醫院腎內科,山西省太原市 030012; 2 山東大學第二醫院腎內科

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)過去一直被認為是一種腎小球疾病,而新近的研究表明,小管損傷和進行性間質纖維化與DN的預后關系更為密切[1]。DN小管間質病變的核心是細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在損傷區的過量堆積[2]。多種細胞因子和生長因子參與了ECM的生成和降解,其中轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族成員發揮了重要作用。根據結構和分子生物學差異,TGF-β超家族可以細分為三個主要家族:TGF-β、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和激活素(activin,ACT)[3]。TGF-β是公認的最強的促纖維化因子,BMP7可對抗TGF-β的作用。而ACT是否參與了DN小管間質纖維化,目前還未見相關報道。ACT是由兩個β亞單位借二硫鍵構成的二聚體蛋白,按照β亞基構成的不同,ACT分為三種形式:ACT-A(βAβA)、ACT-B(βBβB)、ACT-AB(βAβB),目前研究最多的是ACT-A[4]。卵泡抑素(follistatin,FS)是ACT的天然結合蛋白,二者共同構成一個維持組織器官正常生長和代謝的自動平衡系統[5]。本實驗通過體內鏈脲佐菌素(STZ)誘導的DM動物模型,探討ACT-A及FS基因在糖尿病大鼠腎臟的表達,從而為進一步闡明DN的發病機制及臨床防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:清潔級雄性Wistar大鼠,6周齡,體重(200±20)g之間,由山東大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑:STZ購自美國Sigma公司;尿白蛋白試劑盒購自北京福瑞公司;反轉錄和熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司。

1.1.3 引物設計:引物均由上海生物工程公司合成。見表1。

表1 引物序列

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型和分組:將雄性Wistar大鼠隨機分成糖尿病組(DM)和對照組(NC)。DM 組在禁食12h后一次性腹腔注射STZ 60mg/kg(臨用前溶于0.1mo1/L檸檬酸緩沖液,1∶50稀釋,pH4.4),NC組給予相同劑量的溶媒。給藥72h后尾靜脈采血測隨機血糖(BS)＞16.7mmo1/L為糖尿病大鼠。所有大鼠標準飼料飼養,自由飲水。各組分別于造模后4、8、12、16周處死大鼠 6只。處死前 1d,大鼠稱重后單只置于代謝籠中,準確收集24h尿液。腹主動脈取血后分離左腎,置液氮待做PCR檢測。

1.2.2 生化指標:尿白蛋白排泄率(AER)檢測采用放免法。腎臟肥大指數用左腎重/體重(KW/BW)表示。BS、血肌酐(Scr)及尿肌酐(Ucr)用 HITACH-7150自動生化分析儀檢測,肌酐清除率(Ccr)按公式:Ucr×每分鐘尿量(ml)/Scr計算,并以體重校正。

1.2.3 real time-PCR檢測:取全腎組織約50mg左右,按照經典方法用 Trizol試劑、氯仿和異丙醇進行抽提mRNA。檢測純度,按反轉錄試劑盒的說明進行反轉錄,引物由上海生工合成。采用ABI PRISM 7000 HT進行real-time PCR,獲得Ct值。根據公式:Folds=2-ΔΔCt進行各組間比較分析。

2 結果

2.1 一般生化指標的變化 DM組大鼠腹腔注射STZ后,BG 明顯升高,呈消瘦、多飲、多食、多尿、自主活動減少等典型的糖尿病癥狀。實驗第8周,NC組大鼠體重明顯增加,DM組大鼠體重增加緩慢,DM組大鼠腎臟肥大指數(KW/BW)與NC組相比明顯增加,差異有統計學意義(P＜0.01)。與NC組相比,DM組大鼠AER及Ccr從第8周開始呈逐漸增高趨勢,差異有統計學意義(P＜0.01);DM組內16周末與8周末比較亦有統計學差別(P＜0.01)。見表1。

表2 各組大鼠BS、AER、KW/BW 及Ccr的變化( ±s)

表2 各組大鼠BS、AER、KW/BW 及Ccr的變化( ±s)

注:與NC組同一時間點比較,*P＜0.01;DM組內16周末與8周末比較,#P＜0.01。

組別 周數 BS(mmol?L-1) AER(mg?g-1) KW/BW(mg?g-1) Ccr(ml?min-1?kg-1)NC 4 5.59±0.16 0.26±0.02 4.85±0.20 2.60±0.23 DM 26.26±1.58* 0.30±0.03 5.30±0.28 2.95±0.21 NC 8 5.71±0.24 0.28±0.03 4.72±0.28 2.67±0.22 DM 27.22±2.47* 3.67±0.25* 6.84±0.44* 5.12±0.34*NC 12 5.68±0.30 0.30±0.02 4.68±0.34 2.63±0.26 DM 27.97±2.25* 6.25±0.49* 7.75±0.85* 6.31±0.52*NC 16 5.74±0.30 0.31±0.02 4.74±0.33 2.80±0.34 DM 28.19±1.62* 7.36±0.57*# 8.44±0.67*# 6.62±0.56*#

2.2 腎組織ACTβA及FS mRNA表達的變化ACTβA mRNA在NC組只有極微量表達,而DM組大鼠腎組織ACTβA mRNA從第4周起即明顯增加(NC組的3.3倍),于12周時達峰值(NC組的7.7倍),16周時表達量略有下降,但仍明顯高于NC組(P＜0.01)。與 ACTβA相反,FS mRNA 在NC組各時間點大鼠腎組織大量表達,而在DM組其表達量呈逐漸下降趨勢,第4周下降了32.5%,第12周時下降了52.9%,第16周時只能檢測到基礎量表達。見圖1。

3 討論

ACT最早在性腺發現的糖蛋白激素,因特異性促進垂體細胞合成及分泌卵泡刺激素(FSH)而得名,后來發現它具有多種生物功能,屬于TGF-β超家族成員,其作用不僅局限于性腺,而且在組織細胞生長分化、骨形成、胚胎發育、免疫調節、組織損傷修復及炎癥反應過程中均發揮了重要作用。目前研究最多的是ACT-A[3]。FS也是由性腺分離的糖蛋白激素,可抑制垂體細胞分泌FSH,還可與ACT-A高度親和力的結合,阻斷ACT-A的生物學效應[6]。類似于TGF-β,ACT-A的適度表達有助于組織損傷修復,但其過度表達可促進組織纖維化的形成。ACT-A表達與腎臟關系密切。胚胎腎臟發育過程中,輸尿管芽可以檢測到ACT-A。外源性ACT-A可以縮小胚胎腎發育體積,減少腎單位數量[7]。正常成年大鼠腎小管ACT-A幾乎檢測不到,而FS則大量表達。在腎缺血時,外髓腎小管上皮ACT-A分泌增加,而FS則明顯下降。將rh-ACT-A注入腎缺血大鼠體內,可促進腎小管上皮細胞凋亡,抑制腎小管上皮細胞增殖,加重小管損傷[8]。ACT-A在DN小管間質病變中是否發揮一定的作用,目前還未見相關報道。

圖1 real-time PCR檢測ACT A和FN的基因表達

本研究表明,從實驗第8周開始,DM組大鼠AER和Ccr表達增加并于16周時達峰值,符合DN早期功能改變。本研究發現,在STZ誘導的DM大鼠,ACT-A基因在實驗第4周,腎臟功能損傷缺如時,在腎臟表達即開始上調,并于12周時達峰值;與之相反,ACT-A的拮抗劑FS,在NC組大鼠腎臟大量表達,而在DM組,其表達量逐漸下降,呈時間依賴性。這一結果提示ACT-A/FS表達失衡在糖尿病大鼠腎臟損傷的進行性發展中發揮了重要作用。但ACT-A參與糖尿病腎損傷的具體信號轉導機制及外源性補充FS是否可延緩糖尿病腎損傷有待進一步體內外實驗證實。

[1] Thomas MC,Burns WC,Cooper M E.Tubular changes in early diabetic nephropathy〔J〕.Adv Chronic Kidney Dis,2005,12:177-186.

[2] Mason RM,Wahab NA.Ex tracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol,2003,14:1358-1373.

[3] Peng C.T he TGF-beta superfamily and its roles in the human ovary and placenta〔J〕.J Obstet Gynaecol Can,2003,25:834-844.

[4] Welt C,Sidis Y,Keutmann H,et al.Activins,inhibins,and follistatins:from endocrinology to signaling.A paradigm fo r the new millennium〔J〕.Exp Biol Med(Maywood),2002,227:724-752.

[5] T hompson T B,Lerch T F,Cook RW,et al.T he structure of the follistatin:activin complex reveals antagonism of both typeⅠ and type Ⅱ receptor binding〔J〕.Dev Cell,2005,9:535-543.

[6] Hashimoto O,Nakamura T,et al.A novel role of follistatin,an activin-binding protein,in the inhibition of activin action in rat pituitary cells〔J〕 .J Biol Chem,1997,272:13835-13842.

[7] Maeshima A,Nojima Y,Kojima I.The role of the activin-follistatin sy stem in the developmental and regeneration processes of the kidney〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev,2001,12:289-298.

[8] Maeshima A,Zhang YQ,Nojima Y,et al.Involvement of the activin-follistatin system in tubular regeneration after renal ischemia in rats〔J〕 .J Am Soc Nephrol,2001,12:1685-1695.