TBT對青春期雌性SD大鼠卵巢結構及內分泌的影響

熊萬軍 蘇小霞

重慶三峽醫藥高等專科學校,重慶市萬州區 404020

三丁基錫(tributyltin)是有機錫類化合物的一種,為一種具有類似于雄激素的內分泌干擾物[1]。三丁基錫主要是作為木材防腐劑、聚氯乙烯塑料制品的熱穩定劑、工業用冷凝水的滅菌劑和作為殺蟲劑添加到涂料中涂于船體表面[2]。由于工業生產中的廣泛應用,從各種工業廢水及涂料中釋放入水體的TBT則會對環境造成嚴重污染。不僅毒害水生生物破壞生態環境,而且不可忽視的是它們可在食用水生生物機體內富集,被人食用后對人體造成危害[3]。自從發現有機錫化合物對海洋的污染以來,有機錫被認為是迄今為止由人為因素而導致大量進入海洋環境中的毒性最大的化學品之一。有研究表明,三丁基錫可使海洋動物性成熟和繁殖推遲,貝類和腹足綱動物性畸變[4];對人的腎、肝、膽、呼吸系統、腸胃系統、生殖系統、神經系統、免疫系統均有不同程度的毒性作用[5],并具有很強的細胞毒性,其中對細胞凋亡的干擾,作為十分重要和典型的細胞毒性的體現,已成為一個研究熱點。目前三丁基錫類的相關研究主要集中在其對海洋生物的生殖發育影響,對哺乳動物尤其是對青春期哺乳動物的影響研究涉及很少。本研究選擇氯化三丁基錫(tributyltin chloride,TBT)為研究對象,通過體內實驗探索TBT對青春期雌性SD大鼠卵巢及內分泌的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康21日齡雌SD大鼠60只,體重40～50g。

1.2 主要試劑、儀器 TBT純度≥98%(南通虹鼎國際化工公司);睪酮(T)放射免疫測定試劑盒(天津市協和醫藥科技有限公司);雌二醇(E2)放射免疫測定試劑盒,DAB試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司),SP-9000免疫組化染色試劑盒(美國ZYMED公司);食用玉米油(四川嘉里糧油工業有限公司);SN-695A型放射免疫分析儀(上海日環技術開發公司產品),石蠟切片機為德國Leica公司的產品,電子天平為上海精天電子儀器有限公司的產品。

1.3 動物分組及染毒方法 21日齡雌性SD大鼠60只,經2d適應性飼養后,將大鼠隨機分為溶劑對照組、0.5mg/kg染毒組、2.5mg/kg染毒組、5.0mg/kg染毒組、7.5mg/kg染毒組和 10.0mg/kg染毒組。每組有大鼠10只,各組都與玉米油配成相應的溶液,按0.4%體重灌胃,對照組用同樣體積的玉米油灌胃。每天均在上午9:00～10:00進行灌胃,染毒期為30d。實驗過程中各組大鼠均飼以普通飼料,自由飲水,每天稱重1次。

1.4 樣本的處理及指標的觀察

1.4.1 激素的測定:在染毒30d結束后第2天準備采集標本,先稱量每只大鼠的體重,在麻醉狀態下進行眼眶動脈采血,將血樣放入37℃水浴箱中水浴30min,然后以2 500r/min離心10min后,取上層血清放入-20℃冰柜中待用。應用放射免疫法測定大鼠血清T、E2的濃度。

1.4.2 卵巢組織的采集:將采血的大鼠斷頭處死,取出卵巢,用電子天平稱重后,將卵巢用生理鹽水清洗后,經4%多聚甲醛固定,常規脫水、石蠟包埋,切片,作HE染色觀察組織結構改變。

2 結果

2.1 卵巢臟器系數的測定 染毒30d后,各劑量組與對照組的臟器系數變化見表1,不同劑量組卵巢臟器系數的變化規律見圖1。

表1 不同劑量組卵巢臟器系數的變化( ±s)

表1 不同劑量組卵巢臟器系數的變化( ±s)

注:*與對照組相比,P＜0.05;#與0.5mg/kg、2.5mg/kg組相比,P＜0.05。

不同劑量組對照組 0.5mg/kg 2.5mg/kg* 5.0mg/kg 7.5mg/kg# 10.0mg/kg卵巢臟器系數 0.022±0.001 0.023±0.002 0.028±0.002 0.032±0.003 0.042±0.001 0.034±0.001

圖1 不同劑量組臟器系數的變化

由此可見,隨著TBT染毒劑量的增加,卵巢臟器系數有逐漸增加的趨勢(圖 1),7.5mg/kg、10.0mg/kg卵巢臟器系數明顯高于對照組和0.5mg/kg、2.5mg/kg組(P ＜0.05),在 10.0mg/kg組劑量組中卵巢臟器系數卻又出現回落現象。

2.2 血清激素的測定 染毒30d后,各劑量組和對照組血清T、E2的濃度變化見表2,不同劑量組T、E2的變化規律見圖2、圖3。

圖2 不同劑量組T濃度變化

圖3 不同劑量組E2 濃度變化

表2 不同劑量組的血清T和E2濃度比較()

表2 不同劑量組的血清T和E2濃度比較()

注:*與對照組相比,P＜0.05;#與0.5mg/kg組相比P＜0.05。

項目不同劑量組對照組 0.5mg/kg 2.5 mg/kg 5.0mg/kg 7.5 mg/kg 10mg/kg T(pmol/L) 13.811±1.206 9.897±0.859* 8.248±0.485* 7.326±0.285 6.246±0.751 5.701±1.101*E2(mu/ml) 0.575±0.081 0.439±0.063* 0.310±0.071 0.270±0.235 0.118±0.021* 0.052±0.014#

以上分析顯示,隨著 TBT染毒劑量的增加,血清T的濃度逐漸增高,7.5mg/kg、10.0mg/kg組血清T的濃度高于對照組和0.5mg/kg、2.5mg/kg組(P＜0.05),而血清E2的濃度隨著染毒劑量的增加而降低,7.5mg/kg、10.0mg/kg組低于對照組和0.5mg/kg、2.5mg/kg組(P＜0.05)。T的濃度與TBT劑量呈正相關(r=0.873,P＜0.05),E2的濃度與TBT的劑量成負相關(r=0.902,P＜0.05),且具有統計學意義(P＜0.05)。

2.3 卵巢組織學改變 對照組大鼠卵巢可見多個不同發育時期的卵泡,原始卵泡、生長卵泡及成熟卵泡的數量及形態正常,顆粒細胞多層,排列整齊,染色質致密,卵泡膜細胞1～2層(圖 4)。0.5mg/kg、2.5mg/kg組開始出現閉鎖卵泡增多,生長卵泡的數量減少,卵泡內顆粒細胞層減少,排列疏松,卵泡膜-間質細胞增生。5.0mg/kg組上述情況加重,黃體增生,細胞排列呈條狀,部分血管破裂(圖 5)。7.5mg/kg、10.0mg/kg組中,黃體增生更明顯,部分黃體細胞出現空泡樣變化,卵泡數量減少明顯,卵母細胞消失,卵泡膜細胞明顯增生(圖6、7)。

圖4 正常卵巢組織HE×200

圖5 染毒劑量5.0mg/kg 組,卵巢組織 HE×200

圖6 染毒劑量7.5mg/kg 組,卵巢組織 HE×200

圖7 染毒劑量10mg/kg組, 卵巢組織 HE×200

3 討論

卵巢中激素合成中氧化、羥化和脫氫酶活動過程都在細胞漿的粗內質網進行。卵巢組織一般直接吸取血液中的膽固醇作為合成性激素的基質。本實驗顯示TBT實驗組血清睪酮的濃度隨著染毒劑量的增加而增加,而血清雌二醇的濃度隨染毒劑量的增加而減少,均呈現出明顯的劑量效應關系,而HE染色顯示隨著染毒劑量的增加,卵巢功能結構改變比較明顯,閉鎖卵泡增多,卵泡的顆粒層減少,黃體出現空泡樣改變。按照常規,因為卵泡數量的減少,結構功能的嚴重破壞,黃體的功能結構的破壞,血清睪酮的改變應該與雌二醇的改變是同行的,但結構顯示確呈相反樣的改變,這說明了TBT抑制 T轉化為雌酮及雌二醇的功能,并且隨著染毒劑量的增大,這種抑制進一步加重。Ema等[6]研究顯示有機錫化合物抑制豬睪丸中睪酮合成過程中17β-HSD酶的活性。TBT使睪酮分解代謝過程的酶,如5α還原酶,P450芳香化酶的活性減弱[7]。另外,體外培養實驗證實,睪酮誘導或促進卵泡顆粒細胞凋亡,雌二醇則反之[8]。由此可以推測血清睪酮與雌二醇的改變趨勢可能是由于 TBT干擾了這些關鍵酶的代謝所致。

本研究顯示,隨著染毒劑量的增加,卵巢臟器系數存在增加的趨勢,7.5mg/kg組的臟器系數明顯高于對照組。臟器系數可直接反映臟器是否有增生、充血、水腫或萎縮。實驗組臟器系數的增加可能是TBT作用使卵巢的增生或者是水腫所致,在10.0mg/kg劑量組中,臟器系數出現回落趨勢,可是是因為發生萎縮變性所致。膜細胞合成的雄激素透過基膜進入顆粒細胞,在芳香化酶系的作用下雄激素轉變為雌激素。當芳香化酶的活性降低時,雄激素的轉化受到影響,含有雄激素的類固醇不能順利排出,從而影響到卵母細胞發育的微環境,導致了卵細胞凋亡,卵巢功能的降低,重量的減輕。

綜上所述,TBT能夠導致大鼠卵巢的分泌和生殖功能的障礙,且存在著明顯的劑量效應關系。影響的機制可能是TBT首先抑制了芳香化酶的活性,使卵巢分泌的雄激素不能轉化為雌激素,從而使雄激素的濃度過高,雌激素的濃度過低,干擾了大鼠的內分泌功能,導致了卵泡的發育障礙,促進了卵泡的凋亡,從而影響了卵巢的形態和功能。

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