MRPL48基因在代謝綜合征診斷中的意義探討

孫魯寧，張 寧，宋曉宇，鄭寧寧，張海鵬

代謝綜合征 (metabolic syndrome，MS)是各種代謝危險因素在同一個體中簇集的狀態，以中心性肥胖、高血糖、血脂異常、高血壓等聚集發病為特征。近年來，MS發病率在全球呈迅速上升趨勢，歐美等國家MS已累及成年人口的1/4［1］;中華醫學會糖尿病分會的一項最新調查結果顯示，我國MS的總體患病率為13.7%［2］。目前診斷MS的標準主要是依據患者的血生化檢測結果制定的，因患者的個體差異很大，僅憑血生化檢測結果往往不足以反映機體的整體代謝狀況。若能從MS的發病機制入手，在基因或蛋白質水平上找到更加理想的特異性診斷標準，無疑會對MS的臨床診治產生重要的意義。

線粒體是細胞代謝網絡的中心樞紐，它在細胞代謝過程中起著重要作用。近十多年來，線粒體功能與MS的關系正逐漸受到關注。線粒體核糖體負責線粒體基因 (mtDNA)編碼蛋白的翻譯，其異常會引起線粒體膜電位下降和能量產生不足，從而引起體內的各種代謝障礙，進而導致MS的發生。基于此，本研究采用RNA干擾的方法抑制Hela細胞線粒體核糖體大亞基蛋白48(mitochondrial ribosomal proteins，MRPL48)基因的表達，觀察線粒體膜電位的改變，從而明確MRPL48在維持機體能量代謝中的作用，并進一步探討MRPL48在MS臨床診治中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 GIBCO?DMEM培養液、胎牛血清 (Invitrogen公司);MRPL48 shRNA質粒 (Open Biosystems公司);LipofectamineTM2000轉染試劑 (Invitrogen公司);WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒 (博士德公司);MRPL48抗體(Abcam公司);辣根過氧化物酶標記的兔抗人二抗 (Sant Cruz公司);硝酸纖維素膜 (Bio-Rad公司);線粒體熒光染料JC-1(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 Hela細胞培養 向含10%胎牛血清的DMEM培養液中加入100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在7.5%二氧化碳(CO2)培養箱中培養 (37°C)。

1.2.2 病毒包裝和轉染 將PA317細胞接種于6孔板，待其長滿約80%時，使用轉染試劑LipofectamineTM2000將pLNCX逆轉錄病毒表達載體和shMRPL48轉入PA317細胞，6 h后換液，24 h后收集病毒并轉染Hela細胞。

1.2.3 Western blotting方法檢測MRPL48的表達 取40μg蛋白10%SDS-PAGE電泳后轉印至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉該膜37℃ 1 h，再加入MRPL48抗體(1∶500)4℃孵育過夜。經ECL顯影后，用電泳凝膠成像分析系統 (Chemiimager 5500 ALPHA INNOTECH U.S.A)分析光密度值。

1.2.4 JC-1染色法觀察線粒體膜電位的變化 線粒體將產生的能量以電化學位能儲存于線粒體內膜，稱為線粒體膜電位，其變化可作為反映線粒體能量代謝改變的敏感指標。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以檢測到線粒體膜電位的下降。分別收集3×105RNA干擾組和對照組Hela細胞，加入0.5 mg/ml JC-1溶液，37°C避光靜置20 min后，用PBS緩沖液清洗細胞2次，用熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位變化。

2 結果

2.1 RNA干擾組和對照組Hela細胞MRPL48蛋白表達 電泳凝膠成像分析系統分析光密度值顯示:RNA干擾組Hela細胞MRPL48蛋白表達較對照組減少58%(見圖1)，說明shRNA能有效抑制Hela細胞MRPL48蛋白的表達，從而實現基因沉默效應。

圖1 Western blotting檢測RNA干擾組和對照組Hela細胞MRPL48的表達Figure 1 Expression of MRPL48 in RNA interference Hela cells and the control by Western blotting

2.2 線粒體膜電位的變化 JC-1染色顯示，對照組Hela細胞線粒體染色后呈現紅色熒光顆粒，RNA干擾組Hela細胞線粒體綠色熒光顆粒明顯增加 (見圖2)，提示線粒體膜電位下降。

圖2 RNA干擾組和對照組Hela細胞線粒體膜電位改變 (JC-1染色，×40)Figure 2 Mitochondrial membrane potential changes of RNA interference Hela cells and the control(JC-1 staining， ×40)

3 討論

MS是由于先天的遺傳因素與后天的環境因素共同作用引發的一系列臨床、生化和體液代謝失常，從而引起糖類、脂類和蛋白質等多種物質代謝異常的綜合征［3］。因其發病率正逐年增高，且嚴重威脅人類健康，已在世界范圍內受到廣泛的關注。目前臨床上比較常用的MS診斷標準主要有3種，分別為2001年美國國家膽固醇教育計劃成人治療組第三次指南(NCEP-ATPⅢ)標準［4］，2005年國際糖尿病聯盟 (IDF)標準［5］，以及中華醫學會糖尿病學分會根據中國人MS的研究，在2004年提出的診斷標準 (CDS標準)［6］。上述3種診斷標準盡管存在一定的差異，但均是主要依據患者的臨床生化檢測結果制定的。不同的診斷標準檢出的MS臨床患病率差異較大，并且受到年齡、民族、種族、性別等多因素的影響，這就給MS的臨床診治帶來了一定的困擾［7］。故本研究試圖從MS的發病機制入手，在基因或蛋白質水平上找到更加理想的特異性診斷標準。

線粒體是細胞代謝網絡的中心樞紐，涵蓋和控制著約189條生化代謝系列反應，包括呼吸氧化、糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循環、磷脂合成、蛋白質跨膜轉運路徑等。所有糖類、脂類及蛋白質代謝的最后階段都在線粒體內經三羧酸循環完成氧化。因而，Saris等［8］提出:所有代謝障礙最終均可歸因為線粒體的功能異常。線粒體也是哺乳動物細胞內惟一含有核外遺傳物質的細胞器，線粒體基因 (mtDNA)全長僅為16.6 kb(核基因組全長為30億kb)。mtDNA的表達異常可造成線粒體電子傳遞障礙，引起線粒體的能量代謝障礙，進而參與神經退行性疾病、糖尿病、腫瘤等的發生［9-10］。線粒體核糖體負責翻譯13種mtDNA編碼蛋白。作為線粒體核糖體活性中心的線粒體核糖體蛋白 (mitochondrial ribosomal proteins，MRPs)是mtDNA正常表達的基礎。它由核基因編碼，在細胞質中的核糖體上合成，然后轉運到線粒體中，參與線粒體基因的表達［11］，其結構和功能異?？赡軙绊憁tDNA編碼蛋白的合成，使參與代謝的輔酶數量減少或活性降低，并使線粒體氧化磷酸化效率降低，導致糖類、脂類等物質代謝紊亂，同時使ATP產生減少，后者可進一步促進代謝紊亂的發生發展。近年來，人類線粒體核糖體全部78個組成蛋白編碼基因的序列及染色體定位均已明確，使我們對MRP的進一步研究有了可能。我們的前期研究結果已證明，并非所有的MRPs異常都會引起嚴重的代謝障礙［12］。因而，從78種MRPs中鑒定出影響線粒體代謝功能的關鍵蛋白，對于從分子水平上明確MS的診斷具有尤為重要的意義。

基于上述設想，本研究采用RNA干擾的方法抑制Hela細胞MRPL48的表達，觀察到細胞線粒體膜電位下降等損傷性改變，提示此時細胞內發生了代謝障礙。也就證實了MRPL48是影響線粒體功能的關鍵蛋白質，該蛋白在細胞代謝過程中起到了非常重要的作用。MRPL48基因表達減少可能正是在MS患者在分子水平上的特異性變化。若上述設想得到證實，MRPL48將有望作為MS臨床診治的新靶點。今后，我們將繼續開展MS動物模型的研究，以便進一步提供相關的理論和實驗依據。

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