蝎毒多肽抑制白血病干細胞龕內活化的實驗研究*

楊向東，楊文華，史哲新，劉寶山，高 宏，張 蕾，陳艷鑫

（天津中醫藥大學第一附屬醫院血液科，天津 300193)

蝎毒多肽抑制白血病干細胞龕內活化的實驗研究*

楊向東，楊文華，史哲新，劉寶山，高 宏，張 蕾，陳艷鑫

（天津中醫藥大學第一附屬醫院血液科，天津 300193)

[目的]觀察蝎毒多肽（PESV）抑制白血病干細胞（LSC）在骨髓龕內的活化效應。[方法]分離白血病/急性淋巴細胞白血病（AML/ALL）患者LSC，置于Transwell小室中，分為高中低劑量組及對照組，分別加入不同濃度蝎毒多肽后培養，計算不同濃度組及不同時間段的LSC遷移率。[結果]PESV組遷移率分別為（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%，與對照組（49.10±6.12）%比較差異具有顯著性（P<0.05），高劑量組遷移率高于中低劑量組。[結論]不同濃度PESV均有抑制白血病干細胞活化作用，抑制強度呈濃度依賴。

蝎毒多肽；白血病干細胞；龕；活化效應

隨著白血病治療方法不斷進步，治愈白血病面臨最大問題不是如何獲得骨髓形態學緩解，而是如何清除患者體內白血病干細胞（LSC）。筆者研究的蝎毒多肽（PESV）是從東亞鉗蝎蝎毒中分離和純化的提取物，是一種細胞毒成分，具有較強的協同化療藥物殺傷白血病干細胞作用。近年研究表明其協同作用機制之一是抗白血病干細胞多藥耐藥。

1 材料

1.1 標本及白血病干細胞株 2010年1—12月，本院收治的初發及復發急性白血病（AL）患者35例，男 19 例，女 16 例，平均年齡 39.6（14～80）歲。急性非淋巴細胞白血病（ANLL）23例（其中慢性粒細胞白血病急粒變 6 例，ANLL－M53例，ANLL－M210 例，ANLL－M44例），急性淋巴細胞白血病（ALL）12例。初發21例，復發14例（復發患者至少半個月以上未用化療）。無菌操作留取骨髓標本各3m L，肝素抗凝，經磁珠分離法分離白血病干細胞，用RPMI－1640培養液重新懸浮細胞，調整濃度至2×106個/mL備用。

1.2 PESV的制備及鑒定 利用分子篩層析技術對蝎毒凍干粉分離提取，收集蝎毒Ⅲ-Ⅳ蛋白峰。應用高效液相色譜（HPLC）儀，LC/MS聯用技術鑒定結構，蝎毒多肽提取物由50～60個氨基酸殘基組成的多肽，根據SDS不連續聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳（SDS－PAGE）測定結果，分子量主要在 6 000～7 000之間者符合本實驗要求。收集PESV蛋白峰，臨用時PESV用生理鹽水溶解稀釋成各濃度。

1.3 主要試劑及儀器 RPIM－1640（Gibco公司），青霉素、鏈霉素（Hyclone公司），環磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司），類標準胎牛血清（蘭州民海生物公司），Transwell板（Corning公司），Matrigel凝膠（BD公司），抗腫瘤壞死因子（TNF－α），（Peprotech公司），胰蛋白酶（Hyclone公司），錐蟲藍（Amresco公司）。

2 方法

2.1 繪制生長曲線 錐蟲藍染色，選取活細胞數>95%的病例。調整待用細胞懸液細胞數至5×105個/mL，接種于24孔板，每天用錐蟲藍染色計活細胞數，連續7 d，繪制生長曲線。

2.2 錐蟲藍實驗 選取對數生長期的細胞懸液，調整濃度至5×105個/mL，180μL接種于96孔板，分為藥物組和對照組分別加入PESV 1、10、100、1000μg/mL和生理鹽水各20μL，每個藥物濃度設6個復孔，孵箱孵育24 h后錐蟲藍活細胞拒染法測活細胞數。細胞生長抑制率＝（空白孔平均值－加藥組平均值）/空白孔平均值×100%。實驗重復5次。

2.3 LSC在模擬骨髓壁龕中遷移實驗 將8μm孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜上均勻涂一層人工基底膜，5μg/10μL，使之干燥，形成一個基質屏障層。將白血病細胞PBS洗滌后，懸浮于無血清RPMI-1640培養基中，終濃度為2×105個/mL。將細胞懸液加到Transwell小室中，每小室加100μL。24孔板分為實驗組和對照組各加入蝎毒多肽提取物和等量生理鹽水，將小室浸泡于24孔培養板的條件培養基中。37 ℃，5%CO2培養 18 h，取出 Transwell，濾膜用甲醇固定，蘇木精-伊紅染色，水洗，將膜封于載玻片上，于高倍鏡下計數遷移細胞數，每膜計數上、中、下、左、右5個不同位點的透過細胞數，計算平均值。

2.4 統計方法 采用線性相關分析法選擇24 h藥物作用濃度，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 LSC分離培養 見圖1。

3.2 LSC生長曲線 白血病干細胞在體外培養24 h后進入對數生長期，96 h后進入生長平臺期，見圖2。

3.3 PESV（蝎毒多肽）對LSC在模擬骨髓龕中遷移能力的影響 PESV低、中、高濃度均有抑制LSC穿過人工基底膜的能力，其阻抑遷移率分別為（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%。對照組環磷酰胺（CTX）的阻抑遷移率（49.10±6.12）%。PESV組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量與中、高劑量組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；中劑量PESV與低、高劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.05），高劑量組抑制遷移率明顯較高。見表1。倒置顯微鏡下，高劑量組可見侵襲小室下室內細胞數量減少，分布散亂不均，而對照組下室內細胞數量較多，多成簇分布。

表1 PESV抑制LSC透過人工基底膜遷移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

表1 PESV抑制LSC透過人工基底膜遷移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

注：與 PESV 組比較，*P<0.05；與中、低劑量組比較，▲P<0.05。

組別 濃度 遷移率實驗組 PESV低劑量 25.01±6.83 PESV中劑量 36.85±3.83 PESV 高劑量 50.73±7.15▲對照組 CTX 49.10±6.12*

4 討論

目前治愈白血病的關鍵之一是清除患者體內LSC，抑制白血病的復發，不僅僅是如何獲得骨髓形態學緩解、免疫學緩解、遺傳學緩解。LSC靜止于骨髓壁龕內，通常處于G0期，并不進入細胞周期，當骨髓壁龕微環境發生變化時，LSC才會進入細胞周期，開始增殖分化。所以常規化療藥物對LSC無能為力；分子靶向藥物雖然可以識別它，但不能傷害或清除LSC；同樣干細胞移植也不能清除患者體內的LSC。因此，調控LSC長期保持G0期狀態就尤為關鍵，只有這樣才能使控制白血病復發或進展成為可能。

干細胞壁龕的假說是在20世紀70年代針對造血干細胞（HSCs）的特殊微環境而提出來的[1]。現已在多種生物的不同組織中明確了相應干細胞的壁龕細胞，如果蠅卵巢中的帽子細胞、末端絲狀細胞和內發生鞘細胞，哺乳動物骨髓中的成骨細胞等[2]。干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，具有自我更新和高度增殖能力，并可以分化成機體內至少一種成熟細胞。干細胞有多種重要的特征，如自我更新和分化潛能、對稱及非對稱性的分裂方式、處于有絲分裂G0期、具有分化為所寄居組織細胞和跨譜系分化的能力等。干細胞的生物學特性一方面是自身預先程序化的結果；另一方面受其所處微環境的影響[3]。干細胞特征的維持與干細胞所處的壁龕微環境有密切關系。干細胞壁龕可通過與干細胞之間的直接和（或）間接作用，發揮多重生物學功效—錨定干細胞并調控其處于G0期。正常情況下，干細胞寄居在組織或器官特定的壁龕中，這與干細胞和壁龕成分之間表達的黏附分子有關。鈣黏蛋白和整合素介導的細胞黏附是普遍存在的壁龕錨定干細胞的機制[4]。在果蠅卵巢中，生殖干細胞（GSCs）與帽子細胞、體干細胞與內生發鞘細胞之間都存在DE-cadherin，該基因突變可以引起干細胞的丟失；在骨髓造血微環境中，HSCs能定居于以成骨細胞為主的壁龕中就與N-cadherin有關[5]。干細胞表面的整合素可以介導干細胞與ECM之間的黏附，從而使干細胞定居于壁龕中。表皮干細胞一個顯著的特點是與基底膜的黏附，這種黏附也是通過整合素實現的。b1-integrin可以作為特異性較高的表皮干細胞表面標志物。干細胞壁龕可以錨定干細胞的另一個證據是它可以招募新的干細胞，即干細胞的“歸巢”。對經照射宿主的骨髓移植HSCs后觀察，發現移植的HSCs在細胞因子的趨化作用下最終進入宿主骨髓的HSCs壁龕中[6]。同時，干細胞壁龕還為干細胞提供了一個控制增殖、抑制分化的微環境。

現在臨床應用的全蝎多屬東亞鉗科，全蝎主要有效成分是蝎毒多肽提取物PESV，它由多種含有20～80個氨基酸、分子量3 000～10 000蛋白組成，大多數有3～4對二硫鍵交聯而成。PESV作為多種蝎毒抗癌組分中一種，受到越來越多學者的重視。有學者證實PESV至少通過抑制Bcl-2及促進Bax蛋白表達來誘導癌細胞凋亡的[7]；同時還在實驗中發現PESV對數種腫瘤細胞具有毒性作用，可使進入S期的癌細胞明顯減少，G1、S和G2期細胞的百分比增多，從而發揮其抗腫瘤作用[8]。

雖然本研究從體外實驗證實PESV對白血病細胞黏附力及侵襲力的有抑制作用，并呈劑量依賴性，但白血病髓外浸潤的發生是多因素、多環節、多步驟相互影響，相互作用的結果[9]。本課題組將進一步從分子生物學角度探討PESV阻抑白血病髓外浸潤的分子機制。

[1]Lapidot T,Sirard C,Vormoor J,etal.A cell initiating human acute myeloid leukemiaaftertransplantation intoSCIDmice[J].Nature,1994,367(6464):645-648.

[2]Bonnet D,Dick JE.Human acutemyeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].NatMed,1997,3(7):730-737.

[3]Passegue E,Jamieson Ch,Ailles LE,et al.Normal and leukemichematopoiesis:are leukemiasa stem cell disorder or a reacquisitionofstem cellcharacteristics?[J].ProcNatlAcad SciUSA,2003,100(11):11842-11849.

[4]Gilliland DG,Jordan CT,FelixCA.Themolecularbasisof leukemia[J].Hematology,2004(1):80-97.

[5]Hope KJ,J in L,Dick JE.Acutemyeloid leukemia originates from ahierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity[J].Nat Immunol,2004,5(7):738-743.

[6]CozzioA,PassegueE,AytonPM,etal.SimilarMLL-associated leukemiasarising from self-renewing stem cellsand short-livedmyeloid progenitors[J].GenesDev,2003,17(24):3029-3035.

[7]張月英，張維東，賈 青.蝎毒多肽提取物誘導前列腺癌DU-145細胞凋亡的實驗研究[J].實用癌癥雜志，2006，21（3）：225－231.

[8]孔天翰，林 山，韓雪飛.蝎毒多肽對腫瘤細胞的抑制作用研究[J].中國病理生理雜志，2004，20（6）：968－972.

[9]楊文華，楊向東，史哲新，等.蝎毒多肽干預白血病細胞浸潤效應及分子機制[J].天津中醫藥，2010，27（1）：15.

Experiment research on PESV for inhibiting activation of leucem ia stem cell in the niche

YANGXiang-dong,YANGWen-hua,SHIZhe-xin,etal
(DepartmentofHematology,The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China)

[Objective]To observe the effectof PESV(peptide extract from scorpion venom)for inhibiting the activation of leucemia stem cells(LSC)in the niche.[Methods]LSCwere isolated from patientswith AML/ALL and stored in the Transwell.Then theywere divided into four groups:high-dose group,middle-dose group,low-dose group and the positive control group.After cultured with different concentrations of PESV,the transport ratios of LSC in various concentration groups were computed at different time.[Results]The transportratiosculturedwith differentconcentrationsofPESVwere(25.01±6.83)%,(36.85±3.83)%,(50.73±7.15)%,and therewasasignificant difference compared with thatof the positive controlgroup(49.10±6.12)%(P<0.05).The transport ratio in the high-dose group ismore than that of the middle and lose-dose groups.[Conclusion]All different concentrations of PESV have the inhibiting effects against the activation of LSCwith a inhibiting intensity depending on the concentrationsof PESV.

PESV;LSC;niche;activating effect

R285.5

A

1672-1519(2011)04-0329-03

天津市教委計劃資助項目（OTJCYBJC1150）。

楊向東（1977-），男，碩士，主治醫師，主要從事血液病臨床與實驗研究工作。

2011-04-10）