3種司帕沙星制劑在健康人體內的藥動學及生物等效性研究

劉和鳳，何家才，樊 麗（安徽醫科大學附屬口腔醫院，合肥市 230032）

司帕沙星是第4代氟喹諾酮類藥物，對革蘭陰性菌、陽性菌及厭氧菌具有廣譜抗菌作用，具有口服吸收好、組織分布廣、生物利用度高、消除半衰期長等藥動學特點[1]。1993年首先在日本上市，繼而在法國、英國、比利時、芬蘭及瑞士等國家注冊。我國現已有多種劑型上市，主要以片劑和膠囊劑為主，臨床廣泛應用于治療下呼吸道感染、肺結核、慢性前列腺炎、宮頸炎、口腔感染、根管的沖洗消毒等，其臨床療效及安全性已得到證實。本試驗的目的是研究健康志愿者口服3種司帕沙星制劑后的體內藥動學并評價其生物等效性，為其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp溶劑輸送泵、SPD-10Avp紫外-可見檢測器、Chromato-Solution Light色譜中文數據系統（日本島津公司）；TDL80-2B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇市金成國勝實驗儀器廠）；AL104/01型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

受試制劑1:司帕沙星膠囊（江蘇萬高藥業有限公司，規格:每粒100 mg，批號:080911）；受試制劑2:司帕沙星片（江蘇萬高藥業有限公司，規格:每片100 mg，批號:080915）；參比制劑:司帕沙星膠囊（鄭州永和制藥有限公司，規格:每粒100 mg，批號:060301）；司帕沙星標準品:（中國藥品生物制品檢定所，批號:130461-200501，含量:99.8%）；內標:加替沙星標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號:130518-200402，含量:99.4%）；三乙胺、甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim-packVP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調pH至2.87）∶乙腈＝80∶20；流速:1.0 mL·min－1；柱溫:26 ℃；檢測波長:298 nm；靈敏度:0.005AUFS；進樣量:20 μL。在該色譜條件下，司帕沙星和內標加替沙星分離良好，不受血漿色譜峰的干擾，內標加替沙星和司帕沙星的保留時間分別約為4.7 min和5.6 min。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.司帕沙星標準溶液+內標溶液；C.空白血漿+司帕沙星標準溶液+內標溶液；D.受試者服藥4 h后血漿+內標溶液；1.加替沙星；2.司帕沙星Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.sparfloxacin standard solution+internal standard；C.blank plasma+sparfloxacin standard solution+internal standard；D.plasma 4 h after administration+internal standard；1.gatifloxacin；2.sparfloxacin

2.2 受試者選擇

選擇24名男性健康志愿者，年齡19～25歲，平均年齡（22.38±1.60）歲，平均體重（61.13±5.33）kg，體重指數20～24。受試前經病史詢問、體格檢查及血、大小便常規檢查均正常，無藥物過敏史，無煙、酒嗜好，本品皮試陰性，試驗前2周及試驗過程中未服用其他任何藥物。受試者試驗前均簽署知情同意書，且本試驗方案經安徽醫科大學醫學倫理委員會批準通過。

2.3 試驗方案

采用3制劑3周期雙重3×3拉丁方交叉試驗設計。將24名志愿者隨機分成A、B、C 3組，分別服用受試制劑和參比制劑。受試者于前一日晚餐后，禁食禁水12 h，次日清晨在前臂靜脈安置留置針，抽取空白血樣（服藥前0 h）3 mL后，用200 mL溫開水送服（3種制劑的服用量均為400 mg），分別于服藥后0.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h時各采血3 mL，血標本收集于肝素抗凝管內，室溫靜置后離心分離血漿，血漿樣本置－20℃低溫冰箱，避光保存備測。服藥后2 h可飲水，4 h和10 h進統一清淡飲食。洗脫期2周，清洗期密切觀察受試者的一般情況，2周后交叉服藥，連服藥3周期。試驗期間由醫護人員監護。

2.4 血漿樣品的處理

精密量取血漿200 μL置1.5 mL具塞試管中，精密加入內標（29 μg·mL－1加替沙星）溶液10 μL混勻，精密加入甲醇300 μL，于快速混勻器上混合2 min沉淀蛋白，靜置10 min后，置于高速冷凍離心機以12000 r·min－1離心10 min，取出上清液于另一試管中再以12000 r·min－1離心10 min，取第2次離心后上清液20 μL直接進樣分析，以內標法定量。

2.5 標準曲線的制備及最低檢測濃度

精密吸取不同濃度的司帕沙星標準貯備液10 μL，置1.5 mL具塞試管中，加入空白血漿200 μL，配制成每毫升血漿含待測物司帕沙星分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL－1的標準血漿樣本，按“2.4”項下自“精密加入內標（29 μg·mL－1加替沙星）溶液10 μL”起同法操作，以“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜。以待測物司帕沙星濃度（X）為橫坐標，司帕沙星色譜峰面積（As）與內標加替沙星色譜峰面積（Ai）的比值（Y）為縱坐標，用加權（1/X2）最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為Y＝－0.004+0.774X（r＝0.9990，n＝7）。結果表明，司帕沙星血藥濃度在0.0625～4.0 μg·mL－1范圍內線性關系良好，最低檢測濃度（最低定量下限）為0.0625 μg·mL－1（S/N＞10）。

2.6 回收率及精密度試驗

取1.5 mL具塞試管，分別精密加入不同濃度的司帕沙星標準溶液10 μL及空白血漿200 μL，配制成低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）血漿樣品各3份，按“2.4”項下方法處理，進樣20 μL，得到司帕沙星與內標加替沙星峰面積之比值As（H）/Ai（H）；另取1.5 mL具塞試管，分別精密加入不同濃度的司帕沙星標準溶液及內標加替沙星的標準溶液，配置低、中、高相同濃度的對照品溶液各3份，進樣20 μL，得到司帕沙星與內標加替沙星峰面積之比值As（D）/Ai（D）。按公式[As（H）/Ai（H）]/[As（D）/Ai（D）]×100%計算提取回收率，結果低、中、高3種濃度的回收率分別為69.99%、96.35%、71.54%；RSD分別為4.60%、4.54%、3.09%。另配制低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）的血漿樣品各0.5 mL，按“2.4”項下方法操作，在不同天內連續制備并測定3批，每批樣品測定3個濃度，每個濃度5份樣品，計算日內和日間的相對標準差（RSD）。結果日內和日間的RSD均＜15%，表明方法的精密度良好。

2.7 穩定性試驗

配制低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）的血漿樣品，每個濃度各4份，一份立即按“2.4”項下方法操作，測定血漿中藥物濃度；第2份室溫放置24 h后，同法測定血漿中藥物濃度，考察血漿樣品在室溫條件下的穩定性；第3份于－20℃保存7 d后，自然解凍后，同法測定血漿中的藥物濃度，考察樣品在冷凍條件下的穩定性；第4份反復凍融3次后，同法測定血漿中藥物濃度，考察樣品在凍融條件下的穩定性。結果4份樣品的RSD均＜15%，表明血漿樣品在室溫放置、冷凍儲存及反復凍融情況下穩定。

2.8 藥-時曲線

24名受試者口服司帕沙星受試制劑1、2和參比制劑后的平均藥-時曲線見圖2。

圖2 健康受試者單劑量口服3種司帕沙星制劑400 mg后平均藥-時曲線Fig 2 Mean concentration-time curves of sparfloxacin in healthy volunteers after receiving single dose of 3 kinds of sparfloxacin preparations 400 mg

2.9 藥動學參數

24名受試者口服司帕沙星受試制劑1、2和參比制劑后的主要藥動學參數見表1。

2.10 生物等效性分析

分別對 2 種受試制劑與參比制劑的 cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞進行方差分析和雙向單側t檢驗，受試制劑1、2與參比制劑的cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞相比均無顯著性差異，故2種受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

表1 健康受試者單劑量口服3種司帕沙星制劑400 mg后主要藥動學參數Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of sparfloxacin in healthy volunteers after receiving single dose of 3 kinds of sparfloxacin preparations 400 mg

3 討論

本試驗24名志愿者全部是醫學院學生，平均體重（61.13±5.33）kg，平均年齡（22.38±1.60）kg，全部完成試驗，試驗過程由醫師和護士進行觀察，24名受試者服藥后均未見不良事件的發生。

樣品測定過程中為減少系統誤差，筆者每天建立1條隨行標準曲線計算血藥濃度，并測定低、中、高（0.125、1、4 μg·mL－1）質控樣品3種濃度，確保計算得到的藥物濃度準確可靠。

本試驗血漿樣品的處理與文獻[2，3]報道不同，直接加入色譜甲醇沉淀蛋白，操作方便，適合大批量的血漿樣品檢測。流動相（醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調pH值至2.87）∶乙腈＝80∶20）、柱溫（26 ℃）與文獻[2，3]報道也不同[2，3]。預試驗中，筆者發現文獻報道血漿樣品的處理方法復雜，需加乙腈，再水浴和氮氣吹干；文獻所用的流動相與柱溫靈敏度也較低，專屬性不高。流動相篩選發現采用醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調pH值至2.87）∶乙腈＝80∶20時，內標和試藥峰形最好，出峰時間適宜。

數據處理與統計學分析是利用DAS2.0.1統計軟件計算藥動學參數:t1/2、cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞。其中cmax和tmax均以實測值表示，AUC用梯形法計算，t1/2＝0.693/λz，λz為末端消除常數（用對數藥-時曲線末段直線部分斜率求得），相對生物利用度F＝AUC受試制劑/AUC參比制劑×100%。

分別對 2 種受試制劑和參比制劑的 cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞等進行方差分析和雙單側t檢驗，并進行生物等效性評價。分析受試制劑和參比制劑之間、個體間和周期間變異的統計學意義。

cmax、AUC0～t、AUC0～∞在進行對數轉換后，進行雙單側t檢驗和（1－2α）置信區間考察。AUC在參比制劑的80%～125%作為等效標準，cmax在參比制劑的70%～143%作為等效標準。

受試制劑司帕沙星膠囊、司帕沙星片和參比制劑司帕沙星膠囊相比，在相對生物利用度、吸收程度、達峰時間上均具有生物等效性。

[1]呂增春，邢玉斌.喹諾酮類抗菌藥的分類和進展[J].國外醫藥-抗生素分冊，2001，22（2）:73.

[2]張永東，肖云彬，羅繼名.2種國產司帕沙星制劑的生物等效性研究[J].中南藥學，2008，6（1）:58.

[3]張 琨，馬香芹.司帕沙星片人體生物等效性研究[J].河南職工醫學院學報，2008，20（4）:324.