中國西部健康人群口服替諾福韋富馬酸酯片的藥動學研究Δ

譚瑞，楊俊卿，顏波，尚京川，黃愛龍（1.重慶醫科大學藥理學教研室，重慶市 400016；.重慶醫科大學藥物分析教研室，重慶市 400016；.重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶市 400016）

替諾福韋富馬酸酯（Tenofovir disoproxil fumarate，TDF）是由美國吉利德公司研究開發的一種新型的核苷類逆轉錄酶抑制劑，2001年首次在美國上市，臨床主要用于治療人類免疫缺陷病毒（HIV）感染[1]，并與另一個抗逆轉錄病毒藥物恩曲他濱（Emtricitabine，FTC）作為治療HIV感染的一線藥物[2]。TDF還具有很好的抗乙型肝炎病毒（HBV）活性，美國食品與藥物管理局（FDA）已經批準其用于治療成人慢性乙型肝炎[3，4]。TDF已在國內上市，FTC已在國內生產，均作為抗艾滋病的二線藥物。并且目前國內、外正在進行TDF、TDF聯用FTC作為HIV暴露前預防用藥減少新發HIV感染的研究[5～7]中。國外已有關于TDF的藥動學特征的報道[5]，而在中國人群，僅有1項健康人群TDF單獨給藥的藥動學研究[8]。本文對TDF在中國西部健康人群中的藥動學特征進行了研究，并觀察高脂飲食以及合用FTC對TDF藥動學參數的影響。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相系統，包括G1311A型四元輸液泵、G1328B型自動進樣器、G1314A紫外檢測儀、G1316A型柱溫箱和G1322A型脫氣機（美國Agilent公司）；BS210S電子天平（德國賽多利斯公司）；Bond Elut C18固相萃取柱（200 mg/3 mL，美國瓦力安公司）。

1.2 試藥

TDF片（美國吉利德公司，規格：每片300 mg，批號：A708846）；FTC膠囊（河北醫科大學制藥廠生產，規格：200 mg，批號：100101）；替諾福韋標準品（含量：100%）、拉米夫定標準品（內標，含量：100%）均為杭州英譜科技技術發展有限公司提供；FTC標準品（四川百利制藥有限公司，含量：100%）；甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀、醋酸銨、磷酸、氫氧化鈉、三氯乙酸均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phecda C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護柱：Phenomenex?C18（4.0 mm×3.0 mm，5 μm）；流動相：采用梯度洗脫，其中流動相A為含0.08%三乙胺的20 mmol·L－1磷酸二氫鉀水溶液（稀磷酸調節pH值至3.5），流動相B為甲醇（流動相梯度洗脫程序見表1）；內標：拉米夫定；檢測波長：270 nm；柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min－1；進樣量：100 μL；分析時間：30 min。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process of mobile phase

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 替諾福韋標準溶液：準確稱取替諾福韋標準品10.0 mg，加水溶解，得濃度為1.0 mg·mL－1的標準品貯備液，置于4℃冰箱中保存。試驗前加水依次稀釋為系列標準溶液。

2.2.2 內標溶液：準確稱取拉米夫定標準品15.0 mg，用流動相溶解后定容于500 mL容量瓶中，制備成濃度為30.0 μg·mL－1的內標溶液，置于4℃冰箱中保存。

2.3 血漿樣品處理

精密量取血漿300 μL，加入內標溶液（30 μg·mL－1拉米夫定）20 μL，混勻后加入10%三氯乙酸180 μL，渦旋混勻30 s后于12000 r·min－1離心10 min，吸取上清液，加入1%氫氧化鈉水溶液240 μL中和、混勻，待固相萃取。Bond Elut C18固相萃取柱分別用甲醇3 mL、150 mmol·L－1醋酸銨（pH 5.0）3 mL活化平衡，然后將預處理后的血漿樣品注入固相萃取柱中，常壓下用100 mmol·L－1醋酸銨（pH 7.0）3 mL洗脫水溶性雜質，抽干萃取柱，用甲醇500 μL洗脫并收集洗脫液，氮氣吹干，流動相120 μL復溶，混勻，取100 μL供進樣分析。

2.4 專屬性考察

按選定的色譜條件測得的替諾福韋、內標和血漿中的內源性雜質有很好的分離，特異性良好，其中替諾福韋、內標的保留時間分別為6.54、7.74 min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+2000 ng·mL－1替諾福韋標準溶液+內標（200 ng·mL－1拉米夫定）溶液；C.受試者口服TDF片后血漿樣品；1.替諾福韋；2.拉米夫定Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+2000 ng·mL－1tenofovir standard substance+internal standard（200 ng·mL－1lamivudine）；C.plasma sample of objects after oral dose of tenofovir disoproxil fumarate；1.tenofovir；2.lamivudine

2.5 標準曲線的制備

精密吸取空白血漿1800 μL，分別加入系列標準溶液各200 μL，再加入內標溶液，混勻，制備成含替諾福韋10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0、5000.0 ng·mL－1的血漿樣品，再按“2.3”項下方法處理，進樣測定，記錄色譜。以替諾福韋與拉米夫定的峰面積比（Y）為縱坐標，替諾福韋濃度（X）為橫坐標，采用加權最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為：Y＝0.0027X－0.0362（r＝0.9994）。結果表明，替諾福韋血藥濃度在10.0～5000.0 ng·mL－1范圍內線性關系良好，最低定量限為10.0 ng·mL－1。

2.6 精密度及回收率試驗

制備20.0、200.0、2000.0 ng·mL－13種濃度的標準血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法進行操作、測定，連續5 d，根據隨行標準曲線計算樣品濃度，計算得到血漿中替諾福韋的日內、日間精密度及方法回收率；另以血漿樣品中替諾福韋峰面積與其對照品峰面積比值計算平均提取回收率，結果見表2。

表2 回收率及精密度試驗結果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

表2 回收率及精密度試驗結果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

理論值/ng·mL-1 20.0200.02000.0方法回收率/%119.3±10.2105.4±3.6106.1±2.6日內RSD/%9.63.82.4日間RSD/%9.36.35.4提取回收率/%95.5±6.072.8±3.273.5±2.6

2.7 穩定性試驗

制備20.0、200.0、2000.0 ng·mL－13種濃度的標準血漿樣品，分別按下述方法進行處理，即－20℃反復凍融3次、－20℃存放50 d、常溫下放置24 h后，取樣測定，記錄峰面積。結果，3種濃度標準血漿樣品的RSD均＜5%，表明待測樣品在上述條件下穩定。

2.8 受試者的選擇

中國西部男性健康志愿受試者24名，年齡22～27歲，身高168～176 cm，體重指數均在正常值（19～24）范圍內。全面體格檢查結果良好，受試者無既往病史和藥物過敏史，精神狀態良好，血、尿常規，肝、腎功能及心電、心律、血壓均在正常范圍內，試驗前2周及試驗期間未服用其他任何藥物，所有受試者均簽署知情同意書，試驗方案經重慶醫科大學醫學倫理委員會審批同意。

2.9 給藥方案與采血時間點

24名健康男性志愿受試者隨機分3組，每組8人，分別給予TDF片300 mg、FTC膠囊200 mg+TDF片300 mg、脂肪食物（食物中脂肪比例50%）+TDF片300 mg。受試者于試驗當日早晨埋置靜脈留置針，早晨8時給藥，分別于服藥前0 h和服藥后0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72 h時取靜脈血2 mL，分離血漿，置于－20℃冰箱中冷凍，待測。

2.10 數據處理

以DAS（Ver2.1.1）軟件計算藥動學參數；運用SPSS統計分析軟件，進行藥動學參數組間差異性統計（P＜0.05表示差異有統計學意義）。

2.11 藥動學參數考察

24名健康男性志愿受試者分別口服TDF片、FTC膠囊+TDF片、脂肪食物+TDF后測得替諾福韋的藥-時曲線見圖2。

圖2 健康志愿受試者口服TDF片后的藥-時曲線（±s，n＝8）Fig 2 Plasma concentration-time curves of tenofovi（r±s，n＝8）

DAS（Ver 2.1.1）軟件擬合結果顯示，TDF組、FTC+TDF組、脂肪食物+TDF組中FTC的藥-時數據均符合二室開放性藥動學模型。擬合所有數據，得出藥動學參數，其中cmax、tmax以實測值計算，受試者的主要藥動學參數見表3。

表3 健康志愿受試者口服TDF片后的主要藥動學參數（±s ，n＝8）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of TDF in healthy volunteers after oral dose of TDF tablets（±s ，n＝8）

表3 健康志愿受試者口服TDF片后的主要藥動學參數（±s ，n＝8）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of TDF in healthy volunteers after oral dose of TDF tablets（±s ，n＝8）

與TDF組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.TDF group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

參數cmax/ng·mL-1 tmax/h t1/2/h AUC0～72/μg·h·L-1 AUC0～∞/μg·h·L-1 MRT0～72/h MRT0～∞/h CL/F/L·h-1·kg-1脂肪食物+TDF組429.06±174.81＊1.55±0.37＊13.08±1.47＊＊3569.47±633.47＊＊3856.00±618.39＊＊12.66±1.7216.73±2.751.33±0.20＊＊TDF組290.71±63.211.05±0.1618.78±3.281871.60±377.002284.16±373.5413.41±2.4625.44±4.162.25±0.39 FTC+TDF組420.84±96.71＊1.28±0.30＊12.72±2.83＊＊3869.42±962.85＊＊4107.09±974.82＊＊11.68±4.1315.04±4.411.28±0.28＊＊

利用SPSS統計分析軟件，分別將FTC+TDF組、脂肪食物+TDF組的主要藥動學參數與TDF組經兩組間配對t檢驗。FTC+TDF組、脂肪食物+TDF組分別與TDF組比較，除MRT差異無統計學意義外，其余參數差異均具有統計學意義。

3 討論

研究發現，中國西部健康人群口服TDF片，tmax（1.05±0.16）h，t1/2（18.78±3.28）h，cmax為（290.71±63.21）ng·mL－1，AUC0～72與 AUC0～∞分別為（1871.60±377.00）、（2284.16±373.54）μg·h·L－1，與文愛東等[8]報道的研究結果相似。國外研究報道TDF口服給藥的主要藥動學參數也與本研究結果相似。這些研究結果表明，中國西部健康人群單獨給予TDF的藥動學特征與國、內外人群均相似。

中國西部健康人群聯合給予FTC與TDF，其藥動學參數與單獨給藥組相比，MRT 無明顯差異，cmax、AUC0～72、AUC0～∞、tmax值明顯增加，而t1/2值降低。與我們的研究結果不同，國外研究報道與FTC合用，對替諾福韋的藥動學參數無明顯影響[9]。我們的研究還發現，與TDF單獨給藥相比，給予脂肪飲食，替諾福韋達峰時間明顯延遲（tmax增加），生物利用度增加（cmax、AUC0～72和AUC0～∞值增加），代謝加快（t1/2β縮短）。與我們的研究結果相似的是，國外有研究報道替諾福韋單獨給藥時生物利用度約25%，而脂肪食物可使其提高到39%，且達峰時間延后約0.75 h，cmax提高約15%，AUC提高約35%[9]。研究結果提示中國西部健康人群可能與歐洲人群存在差異，合用FTC后，TDF在中國人群體內的生物利用度提高，代謝速度也加快。

總之，這些研究結果提示，TDF單獨給予在中國西部健康人群的藥動學特征與國外人群相似，而脂肪食物以及合用FTC可能明顯改變替諾福韋的藥動學特征。這些研究結果對TDF及TDF聯合FTC用于中國人群HIV的治療，以及用于HIV高危人群暴露前預防，可提供重要的參考依據。

[1]崔 嵐，安富榮，王曉珉.核苷酸逆轉錄酶抑制劑替諾福韋DF[J].中國新藥雜志，2004，13（11）：1054.

[2]龍亞秋.艾滋病治療藥物的研究進展[J].藥學服務與研究，2007，7（6）：401.

[3]Quan DJ，Peters MG.Tenofovir disoproxil fumarate for the treatment of hepatitis B virus infection：pharmacokinetics and clinical efficacy[J].Therapy，2007，4（2）：141.

[4]Peters MG，Andersen J，Lynch P，et al.Randomized controlled study of tenofovir and adefovir in chronic hepatitis B virus and HIV infection：ACTG A5127[J].Hepatology，2006，44（5）：1110.

[5]Kearney BP，Flaherty JF，Shah J.Tenofovir disoproxil fumarate：clinical pharmacology and pharmacokinetics[J].Clin Pharmacokinet，2004，43（9）：595.

[6]Anonymous.CDC trials of pre-exposure prophylaxis for HIV prevention[EB/OL].http：//www.cdc.gov/hiv/resources/Factsheets/PDF/prep.pdf.2009-01-26.

[7]Clauson KA，Polen HH，Joseph SA，et al.Role of the pharmacist in pre-exposure chemoprophylaxis（PrEP）therapy for HIV prevention[J].Pharm Pract，2009，7（1）：11.

[8]文愛東，王志睿，楊志福.富馬酸替諾福韋酯膠囊在健康人體內的藥動學研究[J].藥學服務與研究，2007，7（3）：191.

[9]FDA.Document of TRUVADA?（emtricitabine and tenofovir disoproxil fumarate）[EB/OL].http：//www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2008/021752s017lbl.pdf.2009-07-12.