高濃度葡萄糖條件下羅格列酮對NIT-1細(xì)胞增殖、胰島素分泌水平及IRS-2表達(dá)的影響

于冉冉，喬 偉，梁瑜禎，馮樂平*

(1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541004;2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

胰島素抵抗及β細(xì)胞凋亡均與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙有關(guān)。近年研究顯示，胰島素受體底物(IRS)-1和IRS-2是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要活性蛋白，其介導(dǎo)的信號(hào)途徑是胰島素發(fā)揮生物學(xué)作用的必要條件［1］，其中IRS-2可調(diào)控β細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)胰島素分泌［2］。羅格列酮(噻唑烷二酮類藥物)可影響IRS-2表達(dá)［3］，但葡萄糖濃度對其影響的研究較少。2010年5月～2011年4月，我們觀察了不同濃度葡萄糖條件下羅格列酮對胰島β細(xì)胞株NIT-1增殖、胰島素分泌水平及IRS2表達(dá)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 NOD鼠胰島β細(xì)胞株NIT-1(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng));RPMI1640培養(yǎng)基，10%FBS，無水葡萄糖粉，胰島素放射免疫分析藥盒，鼠尾膠原，二甲基亞砜(DMSO)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)。

1.2 NIT-1細(xì)胞分組與處理 將NIT-1細(xì)胞置RPMI1640培養(yǎng)液(含11.1 mmol/L葡萄糖、10%FBS、100 U/L青霉素、100mg/L鏈霉素)中，至對數(shù)生長期后以胰酶消化離心、收集細(xì)胞，按5×104個(gè)細(xì)胞/孔移至24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別用葡萄糖濃度為 5.6、11.1、16.7、22.2、27.6 mmol/L 的RPMI1640培養(yǎng)基處理(每組5個(gè)復(fù)孔)，24 h后隨機(jī)分為對照組、羅格列酮1～3組，分別加入濃度為0、10-7、10-6、10-5mol/L 的羅格列酮培養(yǎng)。

1.3 NIT-1細(xì)胞增殖活性、胰島素分泌水平及IRS-2蛋白表達(dá)檢測 ①細(xì)胞增殖活性:采用MTT法。取1.2各組細(xì)胞，用含20%FBS的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以5 000個(gè)/孔接種到96孔板(每孔體積200 μl)，培養(yǎng)48 h后每孔加MTT溶液，孵育4 h終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值(OD值)。②胰島素分泌水平:取1.2各組細(xì)胞，分別于培養(yǎng)24、48 h后收集細(xì)胞上清液，用放射免疫分析方法按試劑盒操作說明檢測胰島素水平。③IRS-2表達(dá):采用Western blot法。細(xì)胞至對數(shù)生長期后，分別按上述對照組、羅格列酮3組處理方法培養(yǎng)，24 h后提取細(xì)胞蛋白;制備SDS-PAGE膠，將蛋白樣品經(jīng)過變性、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后向PVDF膜上加入抗體孵育，然后用TBST洗滌PVDF膜，在膜上加入Ecl發(fā)光顯示液，X線片曝光、顯影和定影。用一維凝膠電泳分析軟件對X線片顯影的IRS-2蛋白條帶進(jìn)行Western blot半定量分析，相對表達(dá)值=待測定蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示、行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NIT-1細(xì)胞增殖活性 羅格列酮2組和3組細(xì)胞增殖活性均顯著高于對照組，各組細(xì)胞增殖活性在葡萄糖濃度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L＞22.5 mmol/L ＞27.6 mmol/L，見表1。

表1 不同葡萄糖濃度下四組NIT-1細(xì)胞增殖活性(n=5，OD 值，±s)

表1 不同葡萄糖濃度下四組NIT-1細(xì)胞增殖活性(n=5，OD 值，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01

葡萄糖濃度(mmol/L) 羅格列酮1組 羅格列酮2組 羅格列酮3組 對照組5.6 0.166±0.023 0.216±0.023*0.212±0.014*0.128±0.002 11.1 0.217±0.032 0.233±0.016*0.229±0.018*0.212±0.025 16.7 0.175±0.049 0.218±0.034*0.233±0.027*0.162±0.012 22.5 0.144±0.032 0.185±0.045*0.193±0.015*0.131±0.014 27.6 0.132±0.081 0.174±0.076*0.188±0.026*0.119±0.035

2.2 NIT-1細(xì)胞胰島素分泌水平 不同葡萄糖濃度下四組細(xì)胞胰島素分泌水平見表2。在各組同一時(shí)間點(diǎn)，胰島素水平在葡萄糖濃度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L ＞22.5 mmol/L ＞27.6 mmol/L＞5.6 mmol/L。

表2 不同葡萄糖濃度下四組細(xì)胞胰島素分泌水平(n=5，mIU/L，±s)

表2 不同葡萄糖濃度下四組細(xì)胞胰島素分泌水平(n=5，mIU/L，±s)

注:與對照組及葡萄糖濃度為11.1 mmol/L比較，#P＜0.05，*P＜0.01

葡萄糖濃度(mmol/L) 羅格列酮1組 羅格列酮2組 羅格列酮3組 對照組5.6 24 h 147.12±49.22* 174.34±23.18* 164.56±27.54* 112.21±20.35 48 h 283.18±31.61* 218.23±67.37* 255.54±43.62* 123.21±34.28 11.1 24 h 273.53±58.12 320.52±64.23 302.52±59.73 231.43±34.45 48 h 302.30±57.83 318.47±87.34 364.18±84.88 267.89±79.55 16.7 24 h 248.53±29.24# 259.87±58.14# 273.10±47.32 200.45±55.22 48 h 253.84±75.23 283.38±28.84 314.12±73.62 237.12±36.66 22.5 24 h 222.75±65.24* 241.75±66.84* 232.24±68.13* 165.57±13.43 48 h 253.13±61.46 242.14±45.77 312.52±112.03* 212.22±45.77*27.6 24 h 179.56±45.52* 207.84±27.66* 218.58±25.68* 121.33±25.77 48 h 183.44±65.83# 225.62±74.77* 282.55±77.43*148.34±65.30

2.3 NIT-1細(xì)胞中IRS-2表達(dá) 不同葡萄糖濃度下羅格列酮3組IRS-2表達(dá)水平均顯著高于對照組，且前者IRS-2表達(dá)水平在葡萄糖濃度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L＞22.5 mmol/L＞5.6 mmol/L＞27.6 mmol/L，見表3。

表3 不同葡萄糖濃度下羅格列酮3組和對照組IRS-2表達(dá)比較(n=5，±s)

表3 不同葡萄糖濃度下羅格列酮3組和對照組IRS-2表達(dá)比較(n=5，±s)

注:與同一葡萄糖濃度對照組比較，*P＜0.01;除#標(biāo)注的兩種濃度外，余三種濃度兩兩比較，P均＜0.05

葡萄糖濃度(mmol/L) 羅格列酮3組 對照組5.6 4.16±0.52*#2.27±0.34 11.1 6.63±0.89* 2.94±0.85 16.7 4.68±0.86* 2.31±0.58 22.5 2.83±0.34*# 0.42±0.17 27.6 2.66±0.23*0.41±0.68

3 討論

長期髙糖毒性將導(dǎo)致胰島β細(xì)胞增殖減弱、胰島素分泌減少和細(xì)胞凋亡增多。以往文獻(xiàn)報(bào)道，羅格列酮對不同細(xì)胞的增殖有不同影響，在腫瘤細(xì)胞中可作為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)配體從多個(gè)方面抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如上調(diào) p53基因表達(dá)、降低 BCL-2表達(dá)和激活Caspase-3、Caspase-8 等［4］;但其對胰島 β 細(xì)胞的生理作用則眾說紛紜［5，6］。本研究顯示，四組細(xì)胞增殖活性及胰島素分泌水平均在葡萄糖濃度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L ＞22.5 mmol/L ＞27.6 mmol/L，其中羅格列酮1～3組細(xì)胞增殖活性和胰島素分泌量均顯著高于對照組。提示羅格列酮除可改善胰島素抵抗外，尚可明顯增強(qiáng)NIT-1細(xì)胞的增殖和胰島素分泌功能。本研究還顯示，羅格列酮3組在葡萄糖濃度為22.5、27.6 mmol/L培養(yǎng)24 h及葡萄糖濃度為16.7 mmol/L培養(yǎng)48 h時(shí)胰島素分泌水平均顯著高于對照組。提示羅格列酮能夠在高濃度葡萄糖情況下抑制NIT-1細(xì)胞凋亡。

關(guān)于羅格列酮抑制高濃度葡萄糖條件下胰島β細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚不完全清楚。有學(xué)者認(rèn)為可能與激活I(lǐng)NS/PI3K/PKB(Akt)途徑和調(diào)節(jié)下游信號(hào)蛋白表達(dá)有關(guān)。推測PPARγ受體激動(dòng)劑除可通過PI3K/AKT信號(hào)通路減輕胰島素抵抗外，尚可調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞增殖和凋亡。有關(guān)PPARγ激動(dòng)劑的研究認(rèn)為，羅格列酮可通過上調(diào)IRS-2表達(dá)增強(qiáng)胰島素敏感性［7］、恢復(fù)胰島素信號(hào)傳遞及細(xì)胞正常分化。本研究顯示，在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下，羅格列酮3組細(xì)胞中IRS-2水平均顯著高于對照組，且其隨葡萄糖濃度變化的趨勢與細(xì)胞增殖活性、胰島素分泌水平基本一致。提示羅格列酮保護(hù)胰島β細(xì)胞生長和功能的作用與促進(jìn)IRS-2表達(dá)密切相關(guān);機(jī)制可能為通過上調(diào)細(xì)胞PDX-1、NKX6.1、葡萄糖激酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2表達(dá)［8］增加胰島素分泌、激活I(lǐng)NS/PI3K/Akt通路。

綜上所述，高濃度葡萄糖條件下羅格列酮可促進(jìn)NIT-1細(xì)胞增殖、胰島素分泌，機(jī)制可能與上調(diào)IRS-2表達(dá)有關(guān)。

［1］Utzschneider KM，Kahn SE.The role of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Clin Endocrinol Metab，2006，91(12):4753-4761.

［2］DeFronzo RA，Tripathy D.Skeletal muscle insulin resistance is the primary defect in type 2 diabetes ［J］.Diabetes Care，2009，32(2):157-163.

［3］Guilherme A，Virbasius JV，Puri V，et al.Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(5):367-377.

［4］Filippatos TD，Derdemezis CS，Kiortsis DN，et al.Increased plasma levels of visfatin/pre-B cell colony-enhancing factor in obese and overweight patients with metabolic syndrome［J］.J Endocrinol Invest，2007，30(4):323-326.

［5］Rosen ED，Kulkarni RN，Sarraf P，et al.Targeted elimination of peroxisome proliferator-activated receptorm in β cells leads to abnormalities in islet mass without compromising glucose homeostasis［J］.Mol Cell Biol，2003，23(20):7222-7229.

［6］Gurlo T，Haataja LO，Hsueh WA，et al.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma by rosiglitazone protects human islet cells against human islet amyloid polypeptide toxicity by a phosphatidylinositol 3'-kinase-dependent pathway［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90(12):6678-6686.

［7］Lu L，Reiter MJ，Xu Y，et al.Thiazolidinedione drugs block cardiac KATP channels and may increase propensity for ischaemic ventricular fibrillation in pigs［J］.Diabetologia，2008，51(4)675-685.

［8］Yamamoto K，Itoh T，Abe D，et al.Identification of putative metabolites of docosahexaenoic acid as potent PPARgamma agonists and antidiabetic agents［J］.Bioorg Med Chem Lett，2005，15(3):517-522.