馬兜鈴酸對腎小管上皮細胞氧化應激效應的作用

季文萱，黃俊彥*，孟冬梅，劉鳳娟

(1青島市中心醫院，青島266042;2青島大學醫學院附屬醫院，山東省代謝性疾病重點實驗室，青島266003)

馬兜鈴酸(AA)是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物所含的成分，含AA成分的中藥曾在國內外用于治療多種疾病，后因發現其有致突變、致腫瘤和腎毒性等而引起國內外學者廣泛關注［1］。服用含AA中草藥導致的腎損害［即馬兜鈴酸腎病(AAN)］是一種特殊的腎小管—間質損害，其主要表現為進行性腎間質纖維化;該病發展迅速，急性者數月或數年即可發展為終末期腎功能衰竭，國內發病率較高［2］，但其發病機制尚不完全清楚。研究表明，細胞凋亡與AAN發病關系密切;氧化應激可使機體處于易損狀態，同時能增強致病因素的毒性作用，導致基因突變，它不僅與多種疾病的發生、發展有關，也與細胞凋亡有密切關系［3］。目前，對AAN發病機制中氧化應激作用的研究少見報道。2010～2011年，我們觀察了AA對人腎小管上皮細胞(HK-2)氧化應激的效應。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 AA(美國Sigma公司)，噻唑藍試劑盒(Amresco公司)，Annexin-V試劑盒(Invitrogen公司)，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物研究所。HK-2細胞株購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 檢測方法

1.2.1 細胞培養及分組 將HK-2細胞培養于含10%胎牛血清及1%青霉素+鏈霉素的DMEM，在HamsF-12培養基中傳代培養，培養條件為5%CO2、37℃、濕度100%，實驗前24 h更換無血清培養液。實驗分兩組，對照組不加任何藥物;AA組在培養液中加入AA終濃度20 μg/ml。兩組血清濃度一致，培養48 h后終止實驗，每一實驗均重復3次。

1.2.2 細胞超微結構 留取各培養瓶中的培養液，用刮匙收集細胞后分別與原培養液混合，離心棄上清;細胞沉淀后加2.5%戊二醛4℃固定4 h;然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min;1%鋨酸4℃后固定2 h;PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min;乙醇系列梯度脫水，30%、50%、70%、90%、100%的濃度每次10 min(其中100%2次)。再用Epon812環氧樹脂包埋，置37℃、45℃、65℃溫箱固化，每級溫度24 h。用UltracutE超薄切片機半薄切片，甲苯胺藍染色，半薄定位。UltracutE超薄切片機超薄切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色;最后用透射電鏡觀察HK-2細胞的超微結構，拍照讀片。在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。

1.2.3 細胞活性 將細胞培養液置入96孔板，3×104細胞/200 μl，5%CO2、37 ℃孵育，至細胞 80%以上融合，更換無血清培養基繼續培養24 h。加入AA，每組設6個復孔，5%CO2，37 ℃孵育48 h，在倒置顯微鏡下觀察HK-2細胞活性。分別于實驗終止前4 h，在每孔加入 MTT液20 μl，繼續培養4 h。終止培養時，小心吸去孔內培養液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶聯免疫檢測儀在490 nm處測量各孔的OD值。

1.2.4 HK-2細胞凋亡情況 收集細胞1×106個/ml，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，用 PBS 重懸細胞。按照Annexin-V FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，檢測各組HK-2細胞凋亡率。

1.2.5 細胞DNA含量測定 取對數生長期細胞，將細胞密度調至2×105個/ml的細胞懸液于25 ml培養瓶中培養24 h，分組處理HK-2細胞48 h;用含EDTA的胰酶消化并獲取各組1×106個/ml細胞，用PBS沖洗1次，棄上清，用70%乙醇固定，4℃保存14 h以上;離心去除固定液后，用PBS洗2次，加入2 g/L核糖核酸酶A，在37℃下溫育30 min;再加入50 μg/ml的非低滲碘化丙啶4℃孵育20 min，用流式細胞儀獲取1×104個細胞檢測DNA含量，分析G0/G1期峰前DNA含量占細胞總DNA含量的百分比，檢測細胞凋亡比例。

1.2.6 氧化應激反應指標 收集兩組細胞，用胰酶消化后，用PBS沖洗3遍，反復凍融，制成細胞裂解液，高速離心后取適量上清液;應用比色法檢測MDA、GSH-PX活力，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力，分別按照試劑盒說明書檢測，蛋白質定量用考馬斯亮藍法。

1.3 統計學方法 采用SSPS17.0統計軟件，數據以±s表示，組間比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞大體及超微結構 與對照組比較，AA組培養48 h后，其脫落細胞數量明顯增加，大量細胞懸浮于培養液中，貼壁細胞結構不完整;透射電鏡觀察顯示，AA組細胞出現體積變小、染色質凝集或邊集等改變，部分細胞出現崩解、壞死。

2.2 細胞活性及細胞凋亡比例 與對照組比較，AA組培養48 h后，HK-2細胞活性明顯受抑制，凋亡細胞比例明顯增加(見表1)。

2.3 細胞周期和細胞凋亡率 AA組細胞凋亡率為(29.39 ±0.83)%，對照組為(5.03 ±0.26)%，兩組比較有統計學差異(P＜0.05)。AA組作用于HK-2細胞48 h后，G0/G1、G2/M、S期細胞比例發生變化，在G2/M期發生細胞阻滯。

2.4 兩組氧化應激指標比較 見表1。

表1 兩組細胞活性、細胞凋亡比例及氧化應激指標比較(±s)

表1 兩組細胞活性、細胞凋亡比例及氧化應激指標比較(±s)

注:與對照組比較，△P ＜0.05

組別 細胞活性(A值)凋亡細胞比例(%)MDA(nmol/mg)GSH-PX(U)SOD(U/mg)對照組 0.83 ±0.03 5.03 ±0.26 2.19 ±0.12 72.33 ±1.77 80.01 ±1.53 AA 組 0.46±0.11△ 29.39 ±0.83△ 3.55 ±0.19△ 40.06±1.59△ 27.14±1.93△

3 討論

AAN的確切發病機制尚不明確，以往研究多集中在腎小管上皮細胞及腎間質成纖維細胞活化、腎小管上皮細胞轉分化、細胞凋亡及AA-DNA加合物等方面，對腎小管上皮細胞氧化應激效應的研究少見報道［4］。

氧化應激不僅與多種疾病的發生、發展有關，也與細胞凋亡有密切關系［5］。正常情況下，體內活性氧的產生和清除系統處于動態平衡狀態;當機體處于應激狀態時，體內氧化與抗氧化作用失去平衡可出現氧化應激反應。當機體處于氧化應激狀態時，體內組織的細胞活性氧升高超過其清除能力，可引起脂質過氧化水平升高，導致DNA氧化損傷、蛋白質表達異常、細胞凋亡及組織損傷，造成機體損害，甚至發生腫瘤。

MDA是脂質過氧化物，可通過多不飽和脂肪酸的過氧化反應引起細胞損傷。GSH-PX是體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解酶，可特異地催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起重要作用，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷［6］。本研究表明，不同劑量的AA可引起腎小管上皮細胞不同程度、不同類型的結構改變，使腎小管上皮細胞凋亡，導致腎小管上皮細胞大量缺失和腎小管萎縮。與對照組比較，AA組HK-2細胞MDA升高，GSH-PX、SOD活力明顯下降。表明AA可降低HK-2細胞的抗氧化酶活性，造成其抗氧化能力下降，氧自由基產生增多，自由基及其產物清除障礙，導致氧化應激明顯增強，造成多不飽和酸的脂質過氧化。AA誘導HK-2細胞凋亡的機制與其導致的氧化應激損傷有關，AA通過氧化應激途徑能誘導HK-2細胞凋亡，氧化應激可能參與AAN的發病過程。目前，對AA本身還是在其代謝過程中，抑或代謝終產物或綜合上述原因造成的氧化應激損傷尚不明了。防治氧化應激對腎臟的損傷可能是治療AAN的新手段，并有助于進一步研究AAN的發病機制。

［1］Jha V.Herbal medicines and chronic kidney disease［J］.Nephrology(Carlton)，2010，15(suppl 2):10-17.

［2］諶貽璞，陳文.馬兜鈴酸腎病的研究進展［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2002，11(1):63-66.

［3］蘇震，徐少偉，鄭法雷，等.馬兜鈴酸對人腎小管上皮細胞轉分化和凋亡作用的體外實驗研究［J］.中華預防醫學雜志，2002，36(5):301-304.

［4］季文萱.楊成對.劉密新.等.馬兜鈴酸—脫氧核糖核酸加合物的質譜分析［J］.分析化學，2008，36(7):930-934.

［5］Xie J，Guo Q.Apoptosis antagonizing transcription factor protects renal tubule cells against oxidative damage and apoptosis induced by ischemia-reperfusion［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17(12):3336-3346.

［6］Stacchiotti A，Morandini F，Bettoni F，et al.Stress proteins and oxidative damage in a renal derived cell line exposed to inorganic mercury and lead［J］.Toxicology，2009，264(3):215-224.