HPLC法測(cè)定附子與其炮制品中雙酯型生物堿

朱日然， 李啟艷， 朱宗敏， 黃 超

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250012;2.山東省藥品檢驗(yàn)所，山東 濟(jì)南 250010;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

HPLC法測(cè)定附子與其炮制品中雙酯型生物堿

朱日然1， 李啟艷2， 朱宗敏1， 黃 超3

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250012;2.山東省藥品檢驗(yàn)所，山東 濟(jì)南 250010;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

目的 通過測(cè)定附子及熟附片(干片蒸制)、黑順片、熟附片(鮮片蒸制)、鹽附子、炮附片中次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿的量，揭示炮制減毒的科學(xué)內(nèi)涵。方法 樣品采用10%氨水浸潤(rùn)，乙醚超聲提取的方法;色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰醋酸(濃氨水調(diào)節(jié) pH 為7.29)(28 ∶72);檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm;結(jié)果 與生附子相比，次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿在清水黑順片、鹽附子等炮制品中的量大大降低;結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)從化學(xué)的角度闡釋了附子炮制減毒的科學(xué)依據(jù)。

附子;炮制品;雙酯型生物堿;高效液相色譜法

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx子根的加工品，具有回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，逐風(fēng)寒濕邪的功效。附子的化學(xué)成分主要為劇毒的二萜雙酯類生物堿，包括次烏頭堿(hypaeonitine)、烏頭堿(aconitine)、新烏頭堿(mesaconitine)、塔拉弟胺(tatatisameine)、川烏堿甲(Chuan-wu-base A)等成分。為了減其毒性，提高臨床療效，通常対附子進(jìn)行炮制，其炮制品包括黑順片、鹽附子、炮附片等。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相法對(duì)附子與其炮制品中雙酯型生物堿的量進(jìn)行測(cè)定，以考察附子中雙酯型生物堿在炮制過程中的變化及輔料的對(duì)其影響［1-4］。

1 儀器與試藥

SK 5200H型超聲波提取機(jī)(中國(guó)科導(dǎo)超聲儀器有限公司制造);R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);PHS-3C型pH值測(cè)定儀(上?？祪x儀器有限公司);安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)。

烏頭堿(110720-200208)、新烏頭堿(110799-200404)、次烏頭堿(110798-200404)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。生附子購(gòu)自山東省中藥飲片廠，熟附片(干片蒸制)、清水黑順片、熟附片(鮮片蒸制)、鹽附子、無(wú)膽炮附片均為山東省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室炮制。附子經(jīng)山東省中醫(yī)院張學(xué)順教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aeonitum carmichaeliDeb的子根加工品。

2 方法

2.1 色譜條件［5-7］Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.2% 冰醋酸(濃氨水調(diào)節(jié) pH為7.29)(28∶72)，體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。采用此色譜條件，供試品及對(duì)照品色譜分離度良好，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 供試品溶液的制備 取生附子樣品粉末(過40目篩)2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%氨水3 mL，浸潤(rùn)，精密加入乙醚50 mL，超聲提取30 min，濾過，并用15 mL乙醚分3次沖洗藥渣，合并濾液，置50℃水浴揮干乙醚，用0.01%鹽酸-甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 線性關(guān)系的考察 分別精密稱取在60℃減壓干燥4 h的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品適量，加0.01%鹽酸-甲醇制成各含烏頭堿0.027 36 mg/mL、次烏頭堿0.128 3 mg/mL、新烏頭堿0.123 2 mg/mL的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各 1、2、4、8、16、20 μL，注入液相色譜儀，分別測(cè)定峰面積積分值。分別以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得烏頭堿回歸方程y=867.53x－0.452 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，新烏頭堿回歸方程y=1 056x－10.898，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，次烏頭堿回歸方程y=856.84x－7.577，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。表明烏頭堿進(jìn)樣量在0.027 36 ～0.547 2 μg 之間、新烏頭堿進(jìn)樣量在 0.128 3 ～2.566 4 μg之間、次烏頭堿進(jìn)樣量在0.123 2～2.464 μg之間，與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液8 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果烏頭堿的RSD為0.65%、新烏頭堿的RSD為0.71%、次烏頭堿的RSD為0.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取上述供試品溶液10 μL，每隔2 h進(jìn)樣一次，測(cè)定雙酯型生物堿的峰面積積分值，共考察8 h，以觀察樣品溶液在檢測(cè)過程中待測(cè)成分的穩(wěn)定性，結(jié)果烏頭堿峰面積的RSD為0.66%、新烏頭堿峰面積的RSD為0.42%、次烏頭堿峰面積的RSD為0.78%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足測(cè)定需要。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取陜西產(chǎn)生附子樣品粉末(過40目篩)2 g，共取5份，按上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿的量，結(jié)果烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=5)為0.171 8 mg/g，RSD為1.05%;新烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=5)為0.518 1 mg/g，RSD 為1.56%;次烏頭堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=5)為 0.212 6 mg/g，RSD 為 1.74%;表明測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 對(duì)照品貯備液的制備 分別精密稱取在60℃減壓干燥4 h的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加0.01%鹽酸-甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得(烏頭堿濃度為 0.172 5 mg/mL，次烏頭堿濃度為0.507 5 mg/mL，新烏頭堿濃度為 0.211 7 mg/mL)。

取陜西產(chǎn)生附子樣品粉末(過40目篩)1 g，共取5份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每份分別加入上述對(duì)照品貯備液各1 mL，按2.2.1項(xiàng)下方法制得供試品溶液。照上述測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～3。結(jié)果表明，本方法的回收率良好。

表1 烏頭堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The recovry results of aconitine

表2 次烏頭堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The recovry results of mesaconitine

表3 新烏頭堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The recovry results of aconitine hypaconitine

3 樣品的測(cè)定

取待測(cè)樣品粉末(過40目篩)2 g，按2.2.1項(xiàng)下方法制得供試品溶液。進(jìn)樣10 μL，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 9種附子及炮制品的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.4 Determination of 9 kinds of Aconitum carmichaeli and its processed products

4 討論

4.1 最大吸收波長(zhǎng)的考察 取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品溶液，在200～400 nm期間進(jìn)行掃描，結(jié)果3種溶液均在235 nm處有吸收峰，故選用235 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)［8-9］。

4.2 提取方法的考察 根據(jù)附子的性質(zhì)，采用氨水浸潤(rùn)，乙醚超聲法進(jìn)行提取?？疾炝擞绊懱崛〉闹饕蛩匕ò彼昧?、乙醚用量、超聲時(shí)間，并以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，即加10%氨水2 mL，浸潤(rùn)，再精密加入乙醚 50 mL，超聲提取 30 min［10-12］。

4.3 由上述測(cè)定結(jié)果可知:四川江油產(chǎn)生附子的次烏頭堿、新烏頭堿量遠(yuǎn)高于陜西產(chǎn)生附子，而烏頭堿量卻明顯低于陜西生附子。附子的幾種炮制品中，鹽附子的3種雙酯型生物堿基本檢測(cè)不到，黑順片、熟附片(鮮片蒸)、熟附片(干片蒸)僅能檢測(cè)到少量的次烏頭堿，而炮附片除次烏頭堿外仍能檢測(cè)到較高量的新烏頭堿，說(shuō)明經(jīng)過炮制后，鹽附子的毒性已經(jīng)大大降低，黑順片、熟附片(鮮片蒸)、熟附片(干片蒸)中僅有微量的毒性成分，而炮附片中主要毒性成分的含量仍較高。附子皮中的雙酯型生物堿量較生附子有所降低但明顯高于炮制品。

4.4 本實(shí)驗(yàn)從化學(xué)的角度闡釋了附子炮制減毒的科學(xué)依據(jù)。通過比較生附子及其炮制品中3種主要類型生物堿相對(duì)量的變化規(guī)律，結(jié)果表明附子炮制品中烏頭堿幾乎全部破壞，而新烏頭堿和次烏頭堿的量大大降低，從而達(dá)到減毒的目的。

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Analysis of diester diterpenoid alkaloids(DDAs)inAconitum carmichaeliand its processed products by HPLC

ZHU Ri-ran1， LI Qi-yan2， ZHU Zong-min1， HUANG Chao3

(1.Hospital Affiliated to Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250012，China;2.Shandong Provincial Institute for Drug Control，Jinan 250010，China;3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Aconitum carmichaeli;processed product;diester diterpenoid alkaloids(DDAs);HPLC

R284.1

A

1001-1528(2011)08-1375-04

2011-01-12

朱日然(1979—)，本科，主要從事中藥材質(zhì)量及中藥制劑開發(fā)的工作。Tel:(0531)81216522，E-mail:zhuriran@sina.com