HPLC法測定不同產地傣藥腎茶中的迷迭香酸

張麗麗， 敬應春， 彭崇勝， 吳紅兵， 邱明豐

(上海交通大學藥學院，上海 200240)

HPLC法測定不同產地傣藥腎茶中的迷迭香酸

張麗麗， 敬應春， 彭崇勝， 吳紅兵， 邱明豐*

(上海交通大學藥學院，上海 200240)

目的 建立傣藥腎茶中迷迭香酸的測定方法，并測定不同產地腎茶中的迷迭香酸。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱 Agilent TC-C18(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.1%磷酸(25 ∶75);體積流量 1.0 mL/min;柱溫 25℃;檢測波長210 nm，圖譜采集時間為20 min。結果 迷迭香酸在0.16～1.6 μg(r=1)范圍內呈良好線性關系，平均回收率為97.49%，RSD=1.15%(n=9)。結論 該法簡便、準確可行，可用于傣藥腎茶中迷迭香酸的測定及腎茶的質量控制。

傣藥;腎茶;迷迭香酸;高效液相色譜法

傣藥腎茶(西雙版納傣醫稱“芽糯妙”，意譯為“貓 須 草”)來 源 于Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu的全草，傣醫應用歷史長達2000多年，傣醫認為其清香，苦，涼。入土、水塔，具有清熱解毒、利水通淋之功效，用于膀胱濕熱所致的尿急、尿熱、尿痛，非特異性下尿路感染見上述癥候者［1-2］。腎茶中主要含有迷迭香酸、熊果酸、黃酮類及氨基酸等多種成分［3］。其中迷迭香酸藥理活性主要包括抗炎、抗氧化、免疫抑制等，是腎茶主要有效成分之一［4-5］，測定方法主要有分光光度法［6］和高效液相色譜法［7］。目前腎茶飲片［8］和腎茶袋泡茶均無迷迭香酸的測定項目。本實驗建立了測定不同產地腎茶中迷迭香酸的高效液相色譜法，為科學控制腎茶質量提供科學依據，為腎茶制劑質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agient 1200型液相色譜儀，G1322A JP7306-7557在線真空脫氣機，G1311A DE62968658四元泵，G1329A DE64770852自動進樣器，G1316A DE63070860柱溫箱，G1315D DE64259927 DAD檢測器，ChemStation B.03.01色譜工作站(安捷倫科技有限公司);KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AL204 Mettler Toledo電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

迷迭香酸對照品(批號:100415，上海融禾醫藥科技發展有限公司，純度大于98%);20個腎茶樣品經中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所李學蘭研究員鑒定為腎茶Orthosiphonari Status全草，樣品編號及來源見表1。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.1% 磷酸(25 ∶75);體積流量:1.0 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:210 nm，圖譜采集時間為20 min。

表1 樣品編號及來源Tab.1 Number and origins of the samples

2.2 對照品溶液的制備 取迷迭香酸對照品約4 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中加50%甲醇溶解定容，得0.16 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取1～20號腎茶粉末(過4號篩)各約0.36 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇超聲提取30 min，冷卻，定容，搖勻，有機相微孔濾膜(0.45 μm)濾過，備用。

2.4 系統適應性試驗 分別將迷迭香酸對照品及供試品溶液10 μL進樣高效液相色譜儀，理論塔板數以迷迭香酸峰計算不低于20 000，迷迭香酸峰與周圍峰分離度好。對照品及供試品色譜圖見圖1。

2.5 線性范圍考察 分別精密吸取迷迭香酸對照品溶液 1、2、4、6、8、10 μL 進樣，采集色譜圖，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，以對照品的量(μg)為橫坐標(X)，進行回歸處理，得回歸方程:Y=2 447X－9.474，r=1.000。迷迭香酸在 0.16 ～1.6 μg范圍內呈良好線性關系。

2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，相同色譜條件下重復進樣6次，進樣量4 μL，結果顯示峰面積RSD為0.43%。

2.7 穩定性試驗 取20號樣品制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h精密吸取進樣，采集圖譜，測定迷迭香酸峰面積，其RSD為1.95%，表明樣品中迷迭香酸在12 h內穩定。

圖1 迷迭香酸對照品(A)與腎茶供試液(B)色譜Fig.1 HPLC trace of rosmarinic acid(A)and Orthosiphonari Status(B)

2.8 重復性試驗 取20號樣品按2.3項下制備方法，分別制備6份供試液，同一方法采集圖譜，測定迷迭香酸峰面積，并計算其質量分數，其 RSD為0.36%。

2.9 回收率試驗 取腎茶粉末(20號)9份，每份約0.18 g，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，按樣品中成分含有量的80%、100%、120%，分別精密加入迷迭香酸對照品溶液(0.16 mg/mL)，再加50%甲醇超聲提取 30 min，冷卻，定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，進樣10 μL，采集圖譜，根據迷迭香酸峰面積計算(mg)，并計算回收率(%)，結果見表2。

2.10 樣品測定 將收集的腎茶按2.3項下方法制成供試品溶液，同樣色譜條件下進樣(n=3)，采集圖譜，測定結果見表3。不同產地腎茶中迷迭香酸比較見表4。

表2 迷迭香酸的回收率試驗結果Tab.2 Recovery of rosmarinic acid

表3 腎茶中迷迭香酸的測定結果Tab.3 Content of rosmarinic acid

4 討論

4.1 樣品處理方法的選擇 考察了甲醇、水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇等不同提取溶劑，結果表明50%甲醇提取樣品HPLC圖譜雜峰數目少、迷迭香酸峰面積大，提取效果最好，所以選擇50%甲醇作為提取溶劑。比較了超聲波振蕩提取(15、30、45 min)和水浴加熱回流提取(2 h)兩種提取方法，結果顯示超聲15 min所得圖譜峰數目比較少，其他方法所得HPLC圖譜中峰數目以及各峰峰面積沒有明顯差別，考慮到超聲波振蕩提取法簡便易行，所以選擇超聲波振蕩提取(30 min)制備供試品溶液。

表4 不同產地腎茶中迷迭香酸比較Tab.4 Content of rosmarinic acid in Orthosiphonari Status from different habitats

4.2 色譜條件的選擇 本實驗所用色譜條件是在大量摸索試驗以及參考文獻［9-12］的基礎上不斷優化篩選而確定的。曾以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動相進行洗脫，以乙腈-0.1%磷酸為流動相得到圖譜分離效果最好，故選定乙腈-0.1%磷酸作為流動相。

4.3 測定結果 不同產地腎茶中的迷迭香酸量相差較大，云南腎茶最高，浙江、福建和海南三省腎茶居次，老撾、廣東和廣西較低。從迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、免疫抑制等藥理活性角度看，在發揮腎茶這些方面作用時宜選則云南腎茶較佳。

致謝:腎茶樣品采集與鑒定得到了中國醫學科學院藥用植物研究所、西雙版納傣族自治州傣醫醫院(民族醫藥研究所)及相關單位和友人的大力支持與幫助。

［1］云南省食品藥品監督管理局.云南省中藥飲片標準［S］.昆明:云南美術出版社，2005:55.

［2］趙應紅，林艷芳，張麗麗，等.傣藥芽糯妙(腎茶)的研究與應用［J］.中國民族醫藥雜志，2008(10):72-77.

［3］趙愛華，趙勤實，李蓉濤，等.腎茶的化學成分［J］.云南植物研究，2004，26(5):563-568.

［4］李偉光，梁敬鈺.迷迭香酸的研究進展［J］.海峽藥學，2004，16(1):1-4.

［5］陳立亞.迷迭香酸的研究概況［J］.中國藥事，2007，21(11):923-929.

［6］Razzaque A，Ellis B E.Rosmarinic acid production in Coleus cell cultures［J］.Planta，1977，137:287-291.

［7］張繼華，王躍生，柏 健，等.RP-HPLC法測定腎茶中迷迭香酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006，17(1):43-44.

［8］國家地標升國標中成藥部分內科·腎系［S］.2002:54.

［9］劉 偉，丁海杰.HPLC測定夏枯草中熊果酸、齊墩果酸、迷迭香酸的含量［J］.中成藥，2008，30(4):577-580.

［10］王伯濤，王 峰，張同波，等.反相高效液相色譜法測定野菊花中蒙花苷的含量［J］.時珍國醫國藥，2009，20(1):166-169.

［11］王祝舉，趙玉英，王 邠，等.夏枯草中迷迭香酸含量分析方法研究［J］.藥物分析雜志，2006，26(3):399-400.

［12］宋宏剛，裴彩云，趙韶華，等.不同產地野菊花藥材中蒙花苷及總黃酮含量測定［J］.中成藥，2008，30(4):556-559.

Determination of rosmarinic acid inDaiMedicine-Orthosiphonari Status(Shencha)from different habitats by HPLC

ZHANG Li-li， JING Ying-chun， PENG Chong-sheng， WU Hong-bing， QIU Ming-feng*

(School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200240)

DaiMedicine;Orthosiphonari Status(Shencha);rosmarinic acid;HPLC

2011-11-16

云南省科技廳項目(2008IF018，2009BC014);上海市科委項目(08DZ1971303)

張麗麗(1985—)，女，碩士生，從事中藥新制劑研究，Tel:(021)34205051，E-mail:susan.lilizh1224@163.com

*通信作者:邱明豐(1970—)，男，副教授，從事中藥新制劑與新劑型研究。Tel:(021)34204052，E-mail:mfqiu@sjtu.edu.cn

book=8,ebook=19

R284.1

A

1001-1528(2011)08-1378-04