中藥單體對(duì)HepG2細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響*

王 威，王子旭，田 維，史 紅，江海濤

近年來(lái)隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，由高脂飲食和飲酒所致混合性脂肪肝及脂肪性肝炎呈上升趨勢(shì)。各種原因引起肝內(nèi)脂質(zhì)堆積過(guò)多，使得肝臟總脂量超過(guò)肝質(zhì)量的5%，即稱(chēng)為脂肪肝[1]。預(yù)防和治療脂肪肝已經(jīng)成為中、西醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究的重要課題。張伯禮教授在多年臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上提出以疏肝導(dǎo)濁法治療脂肪肝。疏肝導(dǎo)濁方藥由丹參、姜黃、荷葉、何首烏等中藥組成，具有清熱化濕、疏肝利膽的功效。臨床實(shí)踐及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均證明，疏肝導(dǎo)濁方藥對(duì)脂肪肝治療有很好的療效[2-3]。本實(shí)驗(yàn)研究以HepG2細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用中藥單體丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿和何首烏堿對(duì)HepG2肝細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，觀察疏肝導(dǎo)濁方藥中每味中藥單體對(duì)HepG2肝細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因PPARα、HL、ApoB100、ApoAII及 ApoCII表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究疏肝導(dǎo)濁方藥治療脂肪肝的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO公司），小牛血清（Hyclone.com 公司）；胰酶（Gibio公司），胰蛋白酶（Sigma公司），DMSO（Sigma公司），HEPES（Sigma公司），噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司）。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱，（FORMA3111，THERMO公司）；倒置相差顯微鏡，（LEICA DMIL，LEICA公司）；超凈工作臺(tái)，（蘇州安泰公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡SP2（德國(guó)Leica公司）；電泳儀，EC120/CSSU78（美國(guó) Bio Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)，GIS－2019（北京天能公司）；離心機(jī) 6R（Allegra 64，Beckman－Coulter公司）；蠕動(dòng)泵（MILLI PORE 公司）；酶標(biāo)分析儀（THERMO Labsystens公司）。

1.3 細(xì)胞來(lái)源 HepG2肝細(xì)胞株由天津心血管研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為第74代。

2 方法

2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2肝細(xì)胞株在含有DMEM+10%新生小牛血清培養(yǎng)中，消化液采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，胰蛋白酶終濃度為0.25%，EDTA終濃度為0.05%，HepG2細(xì)胞接種于75 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。飽和濕度，貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%瓶底，消化液消化傳代。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將HepG2細(xì)胞分為5組，正常組、丹酚酸B組、姜黃素組、荷葉堿組、何首烏堿組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

2.3.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 每孔加入1mLTrizol，提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為30℃10min，50℃30min，99℃5min，5℃5min為一個(gè)循環(huán)，完成逆轉(zhuǎn)錄。

2.3.2 PCR引物及反應(yīng)條件 見(jiàn)表1。

表1 引物序列（引物由賽百盛公司合成）

反應(yīng)條件：起始變性94℃5min，變性94℃30秒，退火55℃45秒，延伸72℃7 min。β－actin退火溫度為64℃，其余作用條件同上。各體系均進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

2.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物分析 取5 μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，利用凝膠成像分析系統(tǒng)、掃描、拍照，計(jì)算目的基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積與β-actin基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積之比值作為mRNA相對(duì)含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿、何首烏堿對(duì)HepG2細(xì)胞株脂代謝基因 PPARα、HL、ApoB100、ApoAⅡ和ApoCⅡmRNA的表達(dá)水平，見(jiàn)表2。

表2 中藥單體對(duì)HepG2細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響（s）10-6mol/L

表2 中藥單體對(duì)HepG2細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響（s）10-6mol/L

n PPARαHLApoB100ApoAⅡApoCⅡmRNAmRNAmRNAmRNAmRNA空白對(duì)照 6 1.02±0.06 1.01±0.03 1.02±0.07 1.04±0.06 1.04±0.04丹酚酸 B 6 1.34±0.06 1.12±0.04 0.60±0.01 0.99±0.06 1.21±0.06姜黃素 6 1.22±0.05 0.92±0.03 0.60±0.01 1.16±0.07 0.70±0.01荷葉堿 6 1.34±0.05 1.02±0.05 1.07±0.09 1.04±0.07 0.81±0.02何首烏堿 6 0.51±0.01 0.42±0.02 0.72±0.01 1.06±0.04 1.10±0.04組別

丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿能夠刺激HepG2細(xì)胞PPARα mRNA表達(dá)水平升高，而何首烏堿可使PPARα mRNA表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)圖1-A）；丹酚酸B能夠刺激HepG2細(xì)胞HL mRNA水平升高，姜黃素和首烏堿使HL mRNA表達(dá)水平下調(diào)（見(jiàn)圖1-B）；荷葉堿不能刺激HepG2細(xì)胞株ApoB100 mRNA表達(dá)上調(diào)，丹酚酸B、姜黃素、首烏堿均使ApoB100 mRNA表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)圖1-C）；姜黃素能夠刺激ApoAⅡmRNA表達(dá)上調(diào)；丹酚酸B、荷葉堿和首烏堿均不能調(diào)節(jié)ApoAⅡmRNA的表達(dá)（見(jiàn)圖1-D）；丹酚酸B和何首烏堿可升高ApoCⅡmRNA表達(dá)水平，荷葉堿、姜黃素能夠刺激HepG2細(xì)胞ApoCII mRNA表達(dá)水平下調(diào)（見(jiàn)圖1-E）。

圖1 中藥單體對(duì)細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

4 討論

脂肪肝是由于脂質(zhì)代謝紊亂造成脂肪在肝臟內(nèi)沉積而出現(xiàn)的多種病理生理學(xué)病變，主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化，進(jìn)一步發(fā)展可能形成肝硬化[1]。臨床實(shí)踐證明，張伯禮教授的疏肝導(dǎo)濁中藥方治療脂肪肝有很好的療效。丹參總酚酸具有活血，降脂作用，可以使?jié)嵝耙子谙ⅲ业⑽犊嘈越担邢滦兄猓瑢?duì)疏肝導(dǎo)濁具有較好的療效；姜黃性溫，歸脾、肝經(jīng)。研究表明，姜黃素具有降低高脂血癥大鼠血清總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白（LDL-C）的作用，對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化的形成亦有抑制作用。并能提高血清中的總抗氧化能力及過(guò)氧化物歧化酶（SOD）活性，從而降低血脂[4]；荷葉生物堿具有抑制高膽固醇癥和動(dòng)脈粥樣硬化及抗有絲分裂等作用，對(duì)于降低血脂水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝具有較好的效果；何首烏既可養(yǎng)血益肝、固精益腎；又可潤(rùn)腸通便，可以減輕脂肪肝患者的乏力等癥狀。為進(jìn)一步探討張伯禮院士的疏肝導(dǎo)濁法治療脂肪肝的作用機(jī)制，筆者采用疏肝導(dǎo)濁法復(fù)方中藥中各味藥單體丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿和何首烏堿，分別對(duì)HepG2肝細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，觀察這些中藥單體對(duì)HepG2肝細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因PPARα、HL、ApoB100、ApoAⅡ及 ApoCⅡ表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究疏肝導(dǎo)濁方藥治療脂肪肝的作用機(jī)制[1]。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一種同醇類(lèi)激素受體，有3種亞型α，β，γ，其中的PPARα參與調(diào)節(jié)編碼肝脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白AⅡ、載脂蛋白CⅢ等基因的轉(zhuǎn)錄、活化、調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取、結(jié)合及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。在脂質(zhì)代謝中起著重要的作用[2]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿能夠刺激HepG2細(xì)胞PPARα mRNA表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)高密度脂蛋白（HDL）的主要載脂蛋白apoAI，apoAⅡ轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而使血漿HDL升高；降低肝臟apoCⅢ的產(chǎn)生，增加脂蛋白酯酶的表達(dá)；伴隨β氧化增加，降低甘油三酯的水平。

肝脂酶（HL）是體內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)脂代謝的脂酶，不僅具有多種脂酶活性，而且可作為配體促進(jìn)LDL和乳糜微粒（CM）殘粒進(jìn)入肝細(xì)胞而被清除[3]，并能直接參與高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）的逆轉(zhuǎn)運(yùn)和高密度脂蛋白殘粒的分解代謝[4]，HL的主要功能主要與降低血脂有關(guān)，主要作用于極低密度脂蛋白（VLDL）、β-VLDL及VLDL殘粒中的甘油三酯（TG）。HDL中積累的未酯化膽固醇在HL作用下由肝攝取，在HDL3轉(zhuǎn)化為HDL2的過(guò)程中可防止肝外組織過(guò)量膽固醇的積累，其中HL起重要作用。實(shí)驗(yàn)證明，丹酚酸B能夠刺激HepG2細(xì)胞HL mRNA水平升高，HL mRNA的表達(dá)增加有助于肝臟中的脂肪分解代謝，有利于肝臟中β氧化，從而降低肝臟中甘油三酯的含量。

載脂蛋白是構(gòu)成血漿脂蛋白的重要組分，賦予脂類(lèi)以可溶的形式，而且在血漿脂蛋白代謝中起重要作用：1）促進(jìn)脂類(lèi)運(yùn)輸。2）調(diào)節(jié)酶活性。3）引導(dǎo)血漿脂蛋白同細(xì)胞表面受體結(jié)合。是功能上極其活躍的一組血漿蛋白質(zhì)，見(jiàn)表3。ApoB100是LDL受體的配體，其負(fù)責(zé)LDL在體內(nèi)的清理、參與VLDL的合成與分泌、向組織運(yùn)輸脂類(lèi)和膽固醇等，是一種重要的脂蛋白[8]。Espinosa等[9]通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究，認(rèn)為野生型小鼠與ApoB100超表達(dá)的小鼠相比，野生型小鼠對(duì)高脂肪食物的消化和吸收能力較差、血脂水平較低。本實(shí)驗(yàn)中丹酚酸B、姜黃素、何首烏堿、荷葉堿均能刺激HepG2細(xì)胞株ApoB100 mRNA表達(dá)上調(diào)，ApoB100合成增加，可使肝臟中的甘油三酯形成VLDL轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，降低肝脂。另外，ApoAⅡ是HL的激活劑，能夠促進(jìn)HL的活性上升，使肝臟中脂質(zhì)代謝加強(qiáng)。姜黃素和何首烏堿能夠刺激ApoAⅡmRNA表達(dá)上調(diào)。丹酚酸B和何首烏堿可升高ApoCⅡmRNA表達(dá)水平，而ApoCⅡ是LPL的激活劑,能夠促進(jìn)LPL的活性增加使體內(nèi)脂質(zhì)代謝加強(qiáng)。

表3 載脂蛋白及其功能

值得注意的是，不同的中藥單體藥效作用有差別：1）丹酚酸 B 可促進(jìn) PPARα、HL、Apo CⅡ mRNA的表達(dá)，抑制ApoB100 mRNA的表達(dá)，不能調(diào)節(jié)ApoAⅡmRNA的表達(dá)。2）姜黃素可促進(jìn)PPARα、ApoAⅡ mRNA 的表達(dá)，抑制 HL、ApoB100、ApoCⅡmRNA的表達(dá)。3）荷葉堿可促進(jìn)PPARα、HL mRNA的表達(dá)，抑制Apo CⅡmRNA的表達(dá)，不能調(diào)節(jié)ApoB100、ApoAⅡmRNA的表達(dá)。4）何首烏堿能夠促進(jìn)ApoCⅡmRNA的表達(dá)，抑制HL、PPAR、ApoB100 mRNA的表達(dá)，不能調(diào)節(jié)ApoAII mRNA的表達(dá)。

以上實(shí)驗(yàn)可以看出中藥單體藥效作用部位和機(jī)制，明確了中藥單體的相對(duì)作用靶位，也同時(shí)可以比較出復(fù)方中藥作用是多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果，為研究疏肝導(dǎo)濁方藥的治療脂肪肝提供了理論基礎(chǔ)。

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