腦梗死早期側支循環重建及電針干預效應研究*

李桂平，石 磊，杜元灝，李 穎

腦梗死即神經元、膠質和血管的死亡。在大腦組織中，神經元對缺血的耐受性最差，由于大腦幾乎無能量儲備，因而需要持續而充足的血液供應來維持功能，當血液或氧供應停止后，神經元在數分鐘內即發生不可逆損傷[1]。由缺血、缺氧或低血糖等不同病因引起的腦梗死，雖然易損區和組織病理學表現各異，但其最終引起缺血中心部分的細胞由于缺氧而死亡，缺血半暗帶的細胞由于繼發的代謝改變而損傷。

腦梗死急性發生后，腦表面側支血管系統猶如一個“閘門”，決定著腦缺血區能否及時有效地接受來自缺血周邊區的側支循環血流，并壓送這些代償血流進入微細血管，以營養缺血的神經元組織，“閘門”的機能狀態決定著缺血細胞的命運。急性腦梗死發生后，造成“閘門”的阻力增大，開放不利，微血管自律運動出現高頻率低振幅，其流質、流場的動態耦合發生障礙，表現為“高速低效震蕩”，成為缺血腦組織獲取代償血流的障礙，因此，腦梗死發生后，如何迅速而有效的重建微血管側支循環，恢復缺血區及半暗帶的血流供應，成為治療的關鍵。

本研究基于上述理論進行設計，擬達到以下目的：1）以凝集素組織化學技術顯示微血管整體形態，建立可靠的實驗方法。2）直觀反映腦梗死后微血管的形態學變化以及針刺的干預效果，從血管量上反映側支循環建立情況。3）根據腦梗死后電針干預效果，為針刺干預時機的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠（由中國醫學科學院實驗動物養殖中心提供），體質量180~200 g，隨機分為模型對照組、電針干預組和空白對照組。模型對照組、電針干預組又分為1、3、6 h 3個時相組。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 LH202H型韓氏電針儀（中國北京）；Leica CM9100冰凍切片機；恒溫孵育箱；微量進樣器。

1.2.2 主要試劑 蕃茄凝集素（Lycopersicon esculentum agglutinin，Vector公司，產品編號：B-1175）；ABC 染色試劑盒(VECTORSTAIN ABC kit，Vector公司，北京中杉金橋生物有限公司分裝，產品編號：PK-4002）；濃縮型二氨基聯苯胺染色（DAB）試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司，產品編號：ZLI-9032）；0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）；其他試劑均為國產分析純試劑。

2 實驗步驟

2.1 模型復制 采用Longa的腔內線栓法阻滯大鼠左側大腦中動脈，復制腦梗死模型，尼龍線直徑為0.205 mm。大鼠經10%水合氯醛（0.003 mL/g）腹腔內注射麻醉，仰臥于手術臺上，頸正中偏左側切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈，頸總動脈近心端和分叉處放置動脈夾，在兩動脈夾中間扎孔，插入尼龍線拴，長度18~22mm，線栓進入頸內動脈稍遇阻力即停止進線，結扎線拴和頸總動脈，放開頸總動脈近心端動脈夾，縫合皮膚。

2.2 模型納入、排除標準 參照Longa 5分制評分標準，0分：無神經功能缺失癥狀；1分：輕度局灶性神經功能缺失（不能完全伸展右側前肢，左側Horner’s征陽性）；2分：中度局灶性神經功能缺失（提尾懸空時右前肢屈曲、內收，行走時向右側轉圈）；3分：重度局灶性神經功能缺失（站立不穩，向右側傾倒）；4分：不能自發行走，意識水平降低。

評分在1～3分為造模成功，以下兩種情況為模型復制不成功，予以剔除：1）實驗過程中大鼠死亡。2）在規定時間處死動物，取腦時見有蛛網膜下腔出血或頸內動脈分叉部出血。

2.3 處理方法 電針干預組在大腦中動脈梗死（MCAO）后即刻電針刺激人中穴，人中穴定位按華興邦的動物穴位圖譜，用1.7 cm毫針在大鼠鼻中隔下方向上斜刺2 mm，并在該部位下約2 mm處刺入1針作為參考電極，人中穴接電針儀的正極，參考電極接負極，用15Hz，1mA的連續波刺激，持續20min；模型對照組和空白對照組均同樣抓取固定，但不進行任何治療。

2.4 樣本制備 模型對照組、電針干預組分別在MCAO后1、3、6 h規定時間，于一側股靜脈注射生物素化番茄凝集素（1 g/L，溶于生理鹽水)，2 min后，開胸行心臟灌注，灌注液為1%多聚甲醛與0.5%戊二醛混合0.01 mol/mL PBS緩沖液，130 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）壓力連續灌注10 min，取腦，以大腦中動脈和大腦前動脈分叉部為中點前后各2 mm取中間一塊腦組織，30%蔗糖脫水，冰凍切片，切片厚度35μm，連續切片20張，4℃丙酮固定10min，晾干后－20℃保存待檢。

2.5 染色步驟 取冰凍切片，0.01 mol/L PBS緩沖液洗5min×2次；0.01×10-3mol/mLPBS緩沖液（含0.3%Triton X-100）中，37℃孵育4 h；滴加ABC復合物，37℃孵育1 h，0.01 mol/mL PBS緩沖液洗5 min×2次；滴加DAB染色試劑反應15 min；徹底水洗終止反應，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.6 圖像分析 采用Image Pro-Plus圖像分析系統，對每張切片缺血半暗帶內分別隨機選擇5個視野進行測量，檢測參數為血管量。

2.7 統計處理 采用SPSS13.0軟件對各組數據進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析。

3 實驗結果

采用Image Pro-Plus圖像分析系統對圖像進行分析，選擇測量參數為血管總數，導出數據進行統計，結果見表1。

表1 缺血半暗帶內有血流灌注的總血管量（s，n＝6）

表1 缺血半暗帶內有血流灌注的總血管量（s，n＝6）

注：空白對照組有血流灌注的微血管數量平均為(317.00±7.40)，與空白對照組比較*P＜0.001，與模型對照組比較▲P＜0.01。

組別 梗死后1 h模型對照組 136.20±2.96*電針干預組 195.50±5.61*▲梗死后3 h 130.39±9.58*192.50±10.98*▲梗死后6 h 130.83±7.97*186.28±9.82*▲

采用凝集素組織化學技術對各組切片進行染色，空白對照組血管形態，模型對照組和電針干預組缺血半暗帶內腦血管形態如圖所示（圖1、圖2）。

圖1 正常腦血管染色

缺血半暗帶有血流灌注的為血管量統計結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組在MCAO后1、3、6 h血管量均顯著減少，有統計學差異（P＜0.001），電針干預組與相對應模型對照組各時相比較，血管量均顯著增加，有統計學差異（P＜0.01），但是仍顯著少于空白對照組（P＜0.001）。

4 結論

電針干預可增加MCAO模型大鼠缺血半暗帶內有血流灌注的微血管數量，提示電針干預可促進側支循環建立，從而增加這一區域的腦血流灌注，并對梗死區產生一定的影響。

圖2 MCAO模型缺血半暗帶內微血管形態

5 討論

腦梗死后，梗死區的微循環中，血流基本處于停滯狀態，缺血半暗帶微循環中，血流速度下降，細胞聚集度降低，越接近梗死區，下降幅度越大，呈現出一定的梯度變化，相比較其他部位血流速度和細胞聚集度而言，番茄凝集素更容易對這一區域的紅細胞產生凝集作用，使得血流停滯，凝固，并且這種作用不同于一般的血液凝固，其作用力更強，通過心臟灌注的方法，在灌注壓相同的情況下，由于灌注壓在血管系統中遇到阻力逐級遞減，至大腦微循環時灌注液不能將凝集素作用的血管中的血液沖洗掉。對于那些在凝集素靜脈注射前血液已經凝固的血管，凝集素無法隨著血液流動進入這些血管，則不能與特異性糖蛋白結合，最終這些血管中凝固的血液在灌注液的作用下被沖洗掉，但由于沒有凝集素的結合，隨后的染色反應中則不能染出。所以，根據凝集素的特殊反應原理，筆者認為最終通過凝集素組織化學染色出現的微血管，可以看作是腦梗死后仍有緩慢血液流動的部分血管，這部分微循環中的血液正是由側支循環代償而來，所以能夠很好的反映腦梗死后缺血半暗帶和梗死區的微循環狀態，并以此推測側支循環建立的情況及其代償能力。

[1]James F Toole著，龍 潔譯.腦血管疾病[M].第5版，北京：中國協和醫科大學出版社，2004：5.

[2]宗靜杰，褚 芹，鄭建剛.“醒腦開竅”針刺法治療缺血性中風作用機制研究進展[J].天津中醫藥大學學報，2010，29（3）：164-166.