絡通纖溶飲對特發性肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸含量的影響

謝玉蘭 方朝義

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院腫瘤微創介入治療中心，北京 100081)

絡通纖溶飲對特發性肺纖維化大鼠肺組織中羥脯氨酸含量的影響

謝玉蘭 方朝義1

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院腫瘤微創介入治療中心，北京 100081)

目的 觀察絡通纖溶飲對鹽酸博萊霉素誘導特發性肺纖維化(IPF)大鼠肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量的影響。方法 將SD大鼠120只隨機分為正常組、模型組、絡通纖溶飲低劑量組、絡通纖溶飲高劑量組、潑尼松組5組，每組24只(每組再隨機分3批，每批8只)。正常組氣管內滴注0.9%氯化鈉注射液，其余4組大鼠氣管內滴注鹽酸博萊霉素溶液造模。造模后正常組、模型組分別按照10 mL/kg體質量予0.9%氯化鈉注射液灌服，每日1次;絡通纖溶飲低劑量組和高劑量組分別按照12.3、24.6 g/kg體質量予絡通纖溶飲水煎劑灌服，每日1次;潑尼松組按照6 mg/kg體質量予潑尼松混懸液灌服，每日1次。各組大鼠分別于給藥后第7、14、28 d斷頭處死，取右肺中葉組織檢測HYP的含量。結果 28 d內正常組大鼠無死亡，模型組死亡6只，絡通纖溶飲低劑量組死亡3只，絡通纖溶飲高劑量組死亡3只，潑尼松組死亡4只。與本組前一時間段及正常組比較，其余4組HYP含量持續增高(P＜0.05);與模型組比較，同一時間段絡通纖溶飲高劑量組、絡通纖溶飲低劑量組和潑尼松組HYP含量均降低(P＜0.05);與潑尼松組比較，絡通纖溶飲高劑量組、絡通纖溶飲低劑量組HYP均降低，給藥第14、28 d絡通纖溶飲高劑量組HYP含量與潑尼松組比較差異有統計學意義(P＜0.05);絡通纖溶飲高劑量組、低劑量組同一時間段HYP含量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結論 絡通纖溶飲可抑制造模狀態下IPF大鼠肺組織中HYP含量的異常增高。

肺纖維化;中醫藥療法;羥脯氨酸

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種以彌漫性肺泡炎和肺泡結構紊亂最終導致肺間質纖維化為特征的疾病，表現為大量的成纖維細胞聚集，細胞外基質沉積并伴有炎性病變和損傷而呈肺組織結構破壞［1］。目前認為肺的細胞外基質與IPF關系最為密切［2］，羥脯氨酸(HYP)作為肺的細胞外基質中膠原纖維特有的一類氨基酸，含量測定成為間接反應膠原含量的敏感指標而被廣泛應用于肺纖維化的研究［3-4］。我們通過實驗觀察IPF大鼠肺組織中HYP含量的變化，探討絡通纖溶飲對IPF大鼠HYP含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠120只，雌雄各半，體質量200～220 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供［動物合格證號:醫動字0015045，許可證號:SCXK(鄂)2004-2007］，隨機分為正常組、模型組、絡通纖溶飲低劑量組、絡通纖溶飲高劑量組、潑尼松組5組，每組24只(各組再隨機分3批，每批8只)。

1.2 藥物及試劑 絡通纖溶飲(藥物組成:黃芪10 g，麥門冬 12 g，丹參10 g，銀杏9 g，太子參15 g，百合10 g，地龍9 g，虎杖10 g，常規水煎制成湯劑后置于冰箱4℃貯存備用)，醋酸潑尼松片(河南永和制藥有限公司，國藥準字H41024247，5 mg/片)，注射用鹽酸博萊霉素(凍干)(日本化藥株式會社，藥品進口注冊證號H20040205)，戊巴比妥鈉試劑購自國藥集團化學試劑北京有限公司，HYP測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗儀器 FA2004型上皿電子天平由上海精科天平儀器廠提供，微量電動組織勻漿器由北京優尼康生物科技有限公司提供，TGL-16gR型高速冷凍離心機由上海安亭科學儀器廠提供。

1.4 造模方法 除正常組外，其余4組參照文獻［3］方法復制模型，按照40 mg/kg體質量以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定，暴露氣管，按照5 mg/kg體質量氣管內滴注鹽酸博萊霉素溶液，保持大鼠直立體位左右旋轉，使藥液盡可能均勻到達雙側肺部。正常組麻醉、手術方法同造模組，氣管內滴注等容積無熱源0.9%氯化鈉注射液。

1.5 給藥方法 造模第2 d始，正常組和模型組按照10 mL/kg體質量予0.9%氯化鈉注射液灌服，每日1次;絡通纖溶飲低劑量組和絡通纖溶飲高劑量組分別按照12.3、24.6 g/kg體質量予絡通纖溶飲水煎劑灌服，每日1次;潑尼松組按照6 mg/kg體質量予潑尼松混懸液灌服，每日1次。

1.6 標本采集及檢測 各組大鼠分別于給藥后第7、14、28 d斷頭處死。取右肺中葉組織用冰0.9%氯化鈉注射液(0～4℃)沖洗，濾紙吸濕后，稱取濕質量0.3 g，加入冰0.9%氯化鈉注射液沖洗，用微量電動組織勻漿器研磨，鏡檢未見完整細胞后，制成10%的肺組織勻漿。4℃環境下6 000 r/min離心5 min，提取上清液，-20℃凍存，用比色法測定HYP含量。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0統計學軟件，數據采用均數±標準差(±s)表示，用單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。

2 結果

2.1 一般狀態 正常組飲食如常，反應靈敏，體毛順滑光澤，二便正常;無死亡現象。模型組造模后第2 d出現躬不同程度的咳嗽和呼吸困難，第6 d出現躬背蜷縮、瘦弱9只，第10 d出現蜷縮少動，精神萎頓，毛發直立，飲食量減少，第14 d出現毛枯3只;死亡6只(造模后第2 d死亡2只、第8、12 d各死亡1只，第25 d死亡2只)。絡通纖溶飲高劑量組、絡通纖溶飲低劑量組造模后狀態與模型組相似，隨著給藥時間延長于給藥后第5 d多數精神逐漸轉好，毛發漸趨光整，呼吸漸趨平穩，活動增多，食量增加，第6 d分別有3只(絡通纖溶飲低劑量組)和2只(絡通纖溶飲高劑量組)出現躬背蜷縮，瘦弱，2周后各出現毛枯1只;絡通纖溶飲低劑量組死亡3只(造模后第2、8、18 d每批各死亡1只);絡通纖溶飲高劑量組死亡3只(造模后第3、10、15 d每批各死亡1只)。潑尼松組造模后狀態與模型組相似，給藥后第3 d多數狀態好轉，第6 d出現躬背蜷縮，瘦弱5只，第14 d出現毛枯2只;死亡4只(造模后第3 d死亡2只，第7、8 d各死亡1只)。

2.2 各組肺組織中HYP含量比較 見表1。

表1 各組肺組織中HYP含量比較μg/mg，±s

表1 各組肺組織中HYP含量比較μg/mg，±s

與本組前一時間段比較，*P ＜0.05;與正常組比較，△P ＜0.05;與模型組比較，☆P ＜0.05;與潑尼松組比較，#P ＜0.05

組 別 n 第7 d n 第14 d n 第28 d正常組0.75 ±0.03 8 0.75 ±0.02 8 0.77 ±0.04模型組 6 1.82±0.08△ 6 2.62±0.17＊△ 6 3.05±0.17＊△潑尼松組 6 1.44±0.07△☆ 6 1.97±0.16＊△☆ 8 2.21±0.18＊△☆絡通纖溶飲低劑量組 7 1.39±0.11△☆ 7 1.90±0.11＊△☆ 7 2.09±0.15＊△☆絡通纖溶飲高劑量組 7 1.40±0.09△☆ 7 1.80±0.18＊△☆# 7 1.96±0.11＊△☆#8

由表1可見，與本組前一時間段比較，模型組及各治療組HYP含量均持續增高(P＜0.05)，與正常組比較，其余4組HYP含量持續增高(P＜0.05);與模型組比較，同一時間段絡通纖溶飲高劑量組與絡通纖溶飲低劑量組和潑尼松組HYP含量均降低(P＜0.05);與潑尼松組比較，絡通纖溶飲高劑量組與絡通纖溶飲低劑量組HYP均降低，給藥第14、28 d絡通纖溶飲高劑量組HYP含量與潑尼松組比較差異有統計學意義(P＜0.05);絡通纖溶飲高劑量組與絡通纖溶飲低劑量組同一時間段HYP含量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

IPF主要臨床表現為咳嗽、咯痰，后期出現進行性加重的呼吸困難等，同時又具有慢性經過或反復發作等特點，屬于中醫學肺痹、肺痿、咳嗽、喘證等范疇。暴感外邪及慢性消耗等多種原因引起的氣陰耗損、血絡瘀滯是IPF的主要病機特點。在病變過程中，氣虛、陰傷、血瘀三者既產生了不同的病理效應，彼此之間又相互影響，形成了相兼共存、虛實并見的復雜病機，治以益氣養陰祛瘀為法。絡通纖溶飲方中黃芪甘溫不燥，補益脾肺，令氣旺血行，瘀去絡通以起痿廢為君藥;丹參苦寒清泄，具有活血通經，祛瘀止痛之功;麥門冬為滋養清潤之品，具有潤肺養胃、養陰行血之功，二者共為臣藥;太子參補氣生津，百合養陰潤肺止咳，銀杏斂肺定喘，地龍通絡平喘，虎杖活血祛瘀，祛痰止咳共為佐藥。8味相伍，共奏益氣養陰、祛瘀通絡之功。

IPF的特點是細胞外基質過度沉積，肺中膠原蛋白的合成速度大于降解的速度，膠原纖維顯著增多，最終導致膠原的逐漸積累。HYP作為膠原纖維中特有的一類氨基酸，在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中占極少量，其他蛋白中均不存在。膠原合成的一個重要過程是脯氨酸經羥化酶作用轉化為羥脯氨酸，所以HYP含量測定成為間接反應膠原含量的敏感指標而被廣泛應用于肺纖維化的研究［2，4］。有研究認為，炎癥和結締組織增生也是中醫學“瘀”的特征之一，實質是結締組織中成纖維細胞處于活躍狀態，合成過多形態、排列異常的膠原［5］。

本實驗研究采用氣管內滴注鹽酸博萊霉素溶液造模。鹽酸博萊霉素屬于臨床上常用的抗腫瘤藥物，體內給藥后廣泛分布到各組織，其主要的副作用是肺毒性，引起肺泡炎并很快進展為肺纖維化。本研究結果表明，模型組肺組織中HYP含量在各時間段均明顯高于正常組，表明IPF大鼠存在“瘀”的病理狀態，給藥后，絡通纖溶飲高劑量組、絡通纖溶飲低劑量組和潑尼松組HYP含量明顯下降，與同期模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，同時絡通纖溶飲高劑量組肺組織內HYP含量低于潑尼松組(P＜0.05)，提示絡通纖溶飲治療IPF的作用機制是抑制成纖維細胞的活躍狀態，使膠原沉積速度減慢，并使膠原的降解加快，符合中醫學祛瘀生新的功效。

［1］張松華.特發性肺纖維化中西醫治療及展望［J］.遼寧中醫藥大學學報，2009，11(5):79-80.

［2］江瑛，祁鑫，李長天，等.消風除濕膠囊對實驗性早期肺纖維化基質蛋白的影響［J］.甘肅中醫，2001，14(2):57-59.

［3］Ali EN，Mansour SZ.Boswellic acids extract attenuates pulmonary fibrosis induced by bleomycin and oxidative stress from gamma irradiation in rats［J］.Chin Med，2011，30(6):36.

［4］聶莉，程德云，朱剛艷，等.龍血竭對肺纖維化大鼠肺組織轉化生長因子β1mRNA及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響［J］.河北中醫，2010，32(7):1071-1074，封3.

［5］江平，劉錦銘，董偉賢，等.無創正壓機械通氣在特發性肺纖維化呼吸衰竭治療中的應用［J］.河北醫學，2002，8(8):684-687.

Effect of Luotongqianrongyin on the content of hydroxyproline in rat lung tissue with idiopathic pulmonary fibrosis

XIE Yulan*，FANG Chaoyi.*Minimally Invasive Tumor Treatment Center，Beijing You＇an Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing100081

ObjectiveTo investigate the effect of Luotongqianrongyin on the content of hydroxyproline(HYP)in rat lung tissue with idiopathic pulmonary fibrosis(IPF)induced by bleomycin HCI.Methods120 SD rats were randomly divided into five groups，control group，model group，Luotongqianrongyin low dose group，Luotongqianrongyin high dose group and Prednisone group，n=24(each group were randomly divided into three batches，each batch of eight).Normal group

intratracheal instillation of 0.9%sodium chloride injection，and the remaining 4 groups received intratracheal instillation of bleomycin solution for modeling of IPF.After modeling control group and model group received 0.9%sodium chloride injection，10mL/kg.Luotongqianrongyin low dose group and Luotongqianrongyin high dose group received Luotongqianrongyin，12.3 and 24.6 g/kg，once a day respectively.Prednisone group received by 6 mg/kg body weight to the prednisone suspension fed，once a day.The levels of HYP in right middle lobe tissue were detected after the administration of 7，14，28 d rats were decapitated.ResultsThe levels of HYP on 28 days in model group，Luotongqianrongyin low dose group，Luotongqianrongyin high dose group and Prednisone group were increased in comparison with those control group and these four groups of previous time period(P＜0.05).The levels of HYP in Luotongqianrongyin low dose group，Luotongqianrongyin high dose group and Prednisone group were decreased as compared with those in model group at same time period(P＜0.05).The levels of HYP in Luotongqianrongyin low dose group and Luotongqianrongyin high dose group were decreased as compared with those in Prednisone group.There was significant difference between Luotongqianrongyin high dose group and Prednisone group on the level of HYP at ad-ministration of 14，28d(P＜0.05).ConclusionLuotongqianrongyin can inhibit the content of abnormally high levels of HYP in IPF lung tissue in the state of modeling.

Pulmonary fibrosis;Therapy of traditional Chinese medicine;Hydroxyproline

R563.130.531;R341.7;R977.4

A

1002-2619(2011)11-1709-03

1 河北醫科大學中西醫結合學院中醫診斷教研室，河北 石家莊 050091

謝玉蘭(1982—)，女，醫師，碩士。從事中醫肝病臨床工作。

2011-05-31)