大鼠急性腦出血后對重要臟器的影1)響及外周血核因子-κ B表達的研究

邵玉鳳,韓漫夫,任 凱,楊欣建

急性腦出血患者并發多臟器功能障礙綜合征在臨床上較常見,可影響患者的預后,是急性腦血管病致死的主要原因之一。目前在外科與創傷領域,動物及臨床研究均證實全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是發展為全身多臟器功能損害(multiple organ dysfunction syn drome,MODS)的必由之 路[1]。核因子-κ B(nuclear factor kappa B,NF-κ B)在全身炎癥反應中起著關鍵的作用[2]。本實驗觀察大鼠腦出血后肝、腎、肺等臟器功能和病理學改變,及外周血核因子-κ B的表達,了解急性腦出血后對上述重要臟器的影響及其與核因子-κ B表達的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠20只,體重250 g～300 g,由中山醫科大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為腦出血組、假手術組,每組10只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦出血模型制作[3]根據大鼠立體定向圖譜確定擬注入的左側尾狀核位置,將大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,凝固血組大鼠完成立體定向術后從術后從立體定向儀上取下,仰臥位固定,右側腹股溝備皮,縱行切口,暴露并分離右側股動脈,結扎遠心端,用1 mL注射器接4.5號頭皮外穿刺股動脈抽取100 μ L自體動脈血,立即注入更換了針頭的50 μ L微量注射器內,結扎股動脈近心端,縫合皮膚。血液靜置5 min使之充分凝固。微量注射器接套管針將凝固血快速注入靶點內(注射速度20 μ L/min)。留針30 min后拔除套管針。假手術組大鼠完成立體定向術及股動脈抽血,但不注血。

1.2.2 核因子-κ B活性測定 外周血淋巴細胞分離、涂片,抗NF-κ B-p65單克隆抗體購自 Thermo Scientific公司,工作濃度1∶100。假手術組淋巴細胞涂片作為陽性對照。采用 Envision兩步法進行 。結果判定,細胞核上呈現棕黃色為陽性,未見著色細胞者為陰性。每一玻片任選5個高倍視野(×400),計算陽性細胞百分率(陽性細胞數/計數細胞總數×100%)。

1.2.3 血清酶及血氧飽和度含量等測定 各組麻醉后24 h,經腹主動脈取血,離心取上清,使用日立公司的全自動生化分析儀,及血氣分析儀常規測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平及血氧飽和度(SaO2)的水平。

1.2.4 病理形態學觀察 取肝肺組織,經10%中性甲醛固定24 h后,常規石蠟包埋、切片,HE染色。光學顯微鏡下觀察肝臟及肺臟結構形態的改變。

2 結 果

2.1 大鼠腦出血模型觀察 凝固血組所有10只大鼠清醒后觀察其行為改變,均出現右側肢體偏癱,旋轉爬行或拖步行走等,取腦時尾狀核內均可見血腫形成。原發血腫局限在尾狀核內,形態較規則,呈橢圓形,占位效應明顯,表明腦出血模型制作成功。假手術組大鼠未出現上述神經缺損癥狀,腦內亦無血腫形成,可排除腦出血。

2.2 大鼠 ALT、AST、SaO2、BUN、Cr和 NF-κ B 表達的 大鼠腦出血后24 h血清中ALT、AST的含量均明顯增高,血氧飽和度下降,與假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。大鼠急性腦出血后其肝功能及肺功能受損。大鼠腦出血后24 h血清 BUN、Cr的含量均明顯增高,外周血淋巴細胞NF-κ B活性升高,與假手術組比較差異有統計學意義(P＜0.05),大鼠急性腦出血后其腎功能亦受損傷,且核因子-κ B表達升高。詳見表1、表2。

表1 大鼠腦出血后24 h血清A L T、AST等含量(±s)

表1 大鼠腦出血后24 h血清A L T、AST等含量(±s)

組別 n AL T(U/L)AST(U/L)SaO2(%)假手術組 10 47.37±8.02 108.00±22.19 97±23腦出血組 10 113.56±37.12 214.00±78.35 94±18 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表 2 大鼠腦出血后血清 BUN、Cr、NF-κ B含量(±s)

表 2 大鼠腦出血后血清 BUN、Cr、NF-κ B含量(±s)

組別 n BUN mmol/L Cr μ mol/L NF-κ B%假手術組 10 10.01±0.86 17.03±9.01 30.30±4.87腦出血組 10 13.93±5.09 29.06±10.04 42.68±4.05 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 光鏡觀察結果 假手術組大鼠肝臟結構形態正常,腦出血組肝細胞索排列紊亂,灶性肝細胞變性,肝細胞腫脹、排列紊亂,肝竇擴張、淤血,大量炎性細胞浸潤;假手術組肺組織無病理改變;腦出血組肺間隔增厚,間質明顯水腫,大量中性粒細胞浸潤,中度肺出血,組織損傷嚴重。

3 討 論

腦出血常伴有多器官功能損害,究其病因,目前大部分認為是由于急性腦出血后出現全身炎癥反應綜合征(SIRS),失控的全身炎癥反應綜合征造成多種細胞因子及炎性介質的失控性釋放,繼而出現全身多臟器功能損害[1]。本研究發現,急性腦出血大鼠24 h后血清ALT、AST含量明顯增高,血氧飽和度下降,血清BUN、Cr含量明顯增高,說明其肝功能、肺功能及腎功能均有受損,病理切片鏡檢均發現有不同程度的炎癥反應改變,更直接證實了急性腦出血在動物試驗中可造成肝、腎、肺的損害。

細胞核因子-κ B是細胞中一個重要的轉錄因子,是多種炎癥介質的上游信號分子,其激活后可促進多種炎癥介質的產生,處于調節炎癥反應的中心環節。膿毒癥中NF-κ B的活性增加與不良預后有關[4]。選擇性阻斷NF-κ B途徑可影響系統性的全身炎癥反應及多臟器功能障礙發生[5]。本研究發現,在大鼠腦出血后24 h其外周血淋巴細胞核因子-κ B活性升高,與假手術組比較有統計學意義(P＜0.05),且同時伴有大鼠肝、腎、肺功能受損,細胞核因子-κ B活性升高與大鼠腦出血后多臟器功能損害有關。

[1]Neuhold S,Huelsmann M,Strunk G,et al.Comparison ofcopeptin,B-type natriuretic peptide,and amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide in patients with chronic heart failure:Prediction of death at different stages of the disease[J].J Am Coll Cardiol,2008,52(4):266-272.

[2]Sharif-Askari E,Vassen L,Kosan C.Zinc finger protein Gfi1 controls the endotoxin-mediated Toll-like receptor inflammatory response by antagonizing NF-kappaB p65[J].Mol Cell Biol,2010,30(16):3929-3942.

[3]呂田明,陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動脈血腦出血模型[J].中風與神經疾病雜志,2006,23(1):988-941.

[4]Hubert B,Feng Q,T homas Z,et al.Role of NF-κ B in mortality of sepsis[J].Clin Invest,1997,100:972-985.

[5]Xu H,Ye X,Steinberg H.Selective blockade of endothelial NF-kappaB pathway differentially affects systemic inflammation and multiple organ dy sfunction and injury in septic mice[J].Pathol,2010,22(4):490-498.